Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester
Summary
Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Abstract
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Introduction
İnsan beyni tahmini 85000000000 nöron ve glial 1 de dahil olmak üzere 85000000000 bir başka nöronal-olmayan hücreleri ihtiva eder. Olarak İngilizce'ye tercüme 'glia' dolayısıyla Yunan etimolojisi – sinirbilimciler nöronal hücre popülasyonu üzerinde ağırlıklı olarak odaklanmıştır son 100 yıl daha fazla parçası için, glial hücreler inanan nöronlar için yapısal destek sağladı pasif destek hücreleri biraz daha fazla olması 'tutkal'. Son zamanlarda, ancak nöronal-glial etkileşimleri nörobiyoloji, nörofizyoloji ve birçok nörodejeneratif hastalıkların oluşumu ve ilerlemesinde temel yönlerine çok daha temel olabileceğini giderek daha belirgin hale gelmiştir. Serebellar granül hücreleri (CGCs), insan beyninde en bol homojen nöronal nüfus, beyincik hakim ve hücresel bileşenlerin% 90'ından fazlasını oluşturuyor. Sonuç olarak, bu hücreler, t için bir model sistem olarak in vitro kapsamlı olarak kullanılmaktadırO nöronal gelişim, işlev ve patoloji 2-6 çalışma.
Bununla birlikte, CGC kültürleri halen en önemli oranlarda mikroglia ve glia içerir. Sonuç olarak, varsayım olarak farklı hücre tedavilere doğrudan nöronal yanıt veren CGC veriler, aslında ortaya çıkabilecek – kısmen veya toplam – kültürde glia komşu dolaylı, ikincil karşılık gelen. Bu değerlendirme için, seçici olarak, L-lösin metil ester (LME) yardımı ile CGC nöronal kültürlerde mikrogliyal ortadan kaldırmıştır. LME orijinal seçici makrofajlar 7 yok etmek için kullanılan bir lysomotropic madde olduğu için ve aynı zamanda seçici olarak nöral, astrosit ve karışık glial kültürler 8,9,10 gelen mikroglia tüketmek için kullanılmıştır. LME o lizozomal bozulması ve sonraki apoptoz 13,14 sebep olup, makrofajlar ve mikroglia tarafından içselleştirilir. Makrofajlar ve mikroglia onları particula olmaya neden lizozomlarda karakteristik zenginLME tedavisine maruz kalma üzerine rly hassas. Bu protokol GCG'ye ve diğer nöronal / glial kültür sistemleri kullanılarak deneylerde mikroglia katkısını araştırmak için güçlü, henüz basit ve kolay bir yol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
En önemli adımlar CGC gelen mikroglia başarılı bir şekilde seçici olarak ortadan kaldırılmasını sağlamak için ve / veya karışık kültürler: 1) steril ve sağlıklı CGC kültür muhafaza edilmesini; 2) Filtre LME içeren ortamı sterilize ve pH 7.4 çözüm dönen; 3) muhafaza CGC medyayı tutmak ve 37 ° C'de medya LME içeren Isı çarpmasını önlemek için C °; ve 4) hücreler inkübatör dışında tutulur süresini azaltmak için hızlı çalışıyor.
<p class="jove_content…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Materials
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ, ., Winkler, S., Pfeiffer SE, . Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
