Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester

Summary

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Abstract

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis^13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.

Introduction

Le cerveau humain comprend environ 85 milliards de neurones et un autre de 85 milliards de cellules non-neuronales, y compris les cellules gliales ^1. Pour la plus grande partie des 100 dernières années, les neuroscientifiques ont porté principalement sur la population de cellules neuronales, croyant cellules gliales d'être un peu plus de cellules de soutien passives qui ont fourni un soutien structurel pour les neurones – d'où l'étymologie grecque de «cellules gliales» traduit en anglais «colle». Récemment, cependant, il est devenu de plus en plus évident que les interactions neuronales-gliales peuvent être beaucoup plus fondamentale pour les aspects fondamentaux de la neurobiologie, neurophysiologie, et de la genèse et la progression de nombreuses maladies neurodégénératives. Cellules granulaires du cervelet (SCGC), la population neuronale homogène le plus abondant dans le cerveau humain, dominent le cervelet et représentent plus de 90% de ses constituants cellulaires. En conséquence, ces cellules ont été largement utilisées in vitro comme un système modèle pour til étude du développement neuronal, la fonction et la pathologie ^2-6.

Cependant, les cultures de la CCG contiennent encore microglie et d'autres cellules gliales dans des proportions sans doute importantes. En conséquence, les données de la CCG affichant putative réponses neuronales directs à différents traitements de cellules peuvent en fait se produire – en partie ou en totalité – de la réponse secondaire indirecte des cellules gliales voisines dans la culture. Afin d'évaluer cela, nous avons éliminé sélectivement microgliale de la CCG cultures neuronales à l'aide d'ester méthylique de L-leucine (LME). LME est un agent lysomotropic l'origine utilisé pour détruire sélectivement les macrophages ^7, et a depuis été utilisé pour épuiser aussi sélectivement la microglie de neurones, des astrocytes, et les cultures mixtes gliales ^8,9,10. LME est intériorisée par les macrophages et les microglies, dans laquelle il provoque des perturbations lysosomale et l'apoptose subséquente ^13,14. Les macrophages et les cellules microgliales sont caractéristiquement riche dans les lysosomes, les obligeant à être particulièremenrly vulnérables lors de l'exposition à un traitement LME. Ce protocole fournit un moyen puissant, pourtant simple et facile de déterminer la contribution de la microglie dans des expériences utilisant d'autres systèmes de culture neuronales / gliales CGC et.

Protocol

Toutes les expériences décrites ici ont été effectuées en conformité avec le Royaume-Uni Animaux (Scientific Procedures) la loi de 1986. 1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats Préparer deux ciseaux laboratoire en acier inoxydable de dissection et deux pinces de laboratoire en acier inoxydable. Autoclave tous les instruments et les placer dans une culture hotte O / N sous la lumière ultraviolette (UV) pour la stérilisation. Ajouter 500 ml de (ME…

Representative Results

La capacité de cette technique à éliminer sélectivement la microglie à partir de cultures mixtes CCG et / ou repose sur la capacité ultérieure de l'investigateur d'identifier avec précision la microglie et différencier à partir de leurs cellules voisines. Ceci peut être réalisé en utilisant une cellule fabricant spécifique de la microglie, comme isolectine-B4, comme illustré sur la figure 1. Comme le montre la figure 2, aucun changement observable à des astrocyte…

Discussion

Les étapes les plus importantes pour assurer l'élimination sélective de succès de la microglie du CCG et / ou des cultures mixtes sont: 1) le maintien d'une culture de la CCG stérile et en bonne santé; 2) le filtre de stérilisation contenant un milieu LME et renvoyer la solution à pH 7,4; 3) en gardant les médias CCG non répartis et LME contenant les médias à 37 ° C pour éviter un choc thermique; et 4) travaillant rapidement pour réduire le temps cellules sont maintenues à l'ext?…

Materials

Forceps	Sigma-Aldrich	F4142	The curved end facilitates removal of the cerebellum
Micro-dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146	Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection
L-leucine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS solution	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Coat coverslips 1 day before use
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma-Aldrich	T6414
Mouse anti-ED1 antibody	Abcam	ab31630