Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión
Summary
The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Abstract
Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Introduction
Descelularización y recelularización pueden permitir la generación de órganos funcionales, trasplantables in vitro 1. Mediante la eliminación de las células y material antigénico (por ejemplo., ADN, los epítopos alfa-gal) de un órgano, la matriz extracelular no o menos inmunogénico (ECM) se puede obtener. Esta matriz conserva la microanatomía tridimensional de un órgano y puede servir como la biomatriz ideal para repoblación con células de un origen diferente, posiblemente xenogénico 2. Por lo tanto, una matriz de hígado de rata descelularizado podría ser repoblado con células de hígado humano. Este micro-hígado humanizado podría servir como un modelo ex vivo para la investigación de enfermedades (por ejemplo., Enfermedades metabólicas congénitas, enfermedades virales o tumores malignos) o para las pruebas farmacéuticas preclínico 3.
Varios protocolos diferentes para perfusión descelularización hígado de rata ya se han publicado 4-13. En todos los protocolos, decellularzación se logró mediante la perfusión de detergentes iónicos o no iónicos alcalinas través de la vena portal canulado. A lo mejor de nuestro conocimiento, fuimos el primer grupo reportar rata descelularización hígado por perfusión selectiva a través de la vena porta y / o la rata arteria hepática 14. Activación de la perfusión selectiva de los diferentes sistemas vasculares en el hígado puede permitir mejores resultados descelularización y, además, pueden desempeñar un papel importante en la repoblación celular.
En el estudio se detalla aquí, los hígados se perfundieron en un dispositivo de perfusión de propiedad a medida, permitiendo la perfusión bajo condiciones de presión oscilantes. Estas condiciones de presión imitan la perfusión respiratoria dependiente fisiológica del hígado: in situ, el hígado cuelga bajo la cópula del diafragma, cuyo movimiento durante la respiración tiene un impacto directo en la perfusión del hígado. La inspiración conduce específicamente a la reducción del diafragma y apretando del hígado, optimizandoflujo de salida hepato-venosa, mientras que la expiración conduce a la elevación del hígado y disminución de la presión intraabdominal para optimizar flujo de entrada venosa portal-15.
Nuestro objetivo fue evaluar si oscilantes condiciones de presión tienen un impacto en la homogeneidad de la perfusión descelularización hígado de rata imitando condiciones intraabdominales ex vivo. La homogeneidad del proceso de descelularización puede ser un factor subestimado en descelularización perfusión. Todos los agentes conocidos utilizan para Descelularización hígado causan alteraciones en el ECM. Las células en áreas mal perfundidas permanecen dentro de la ECM, mientras que otras áreas están ya completamente descelularizado. Para disolver las células restantes, la duración de la perfusión o la presión deben ser elevados, causando más alteraciones a las áreas bien perfundidos. Por lo tanto, los detergentes para descelularización deben ser distribuidos de forma homogénea dentro del órgano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque la técnica presentada para la cosecha de hígado de rata y descelularización es fácilmente reproducible, hay ciertos pasos críticos a considerar:
Durante la preparación para la cosecha del hígado, es importante para evitar el sangrado grave porque va a activar la coagulación de la sangre y puede conducir a la formación de coágulos de sangre dentro del hígado. En nuestra opinión, es ventajoso incisión en la aorta abdominal directamente antes de la canulación de la vena por…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens and Katharina Struecker for their help during this project.
Materials
| Self built arterial cannula | |||
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0,28mm ID 0,61mm OD |
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58mm ID 0,96m OD |
| Venodrop Safe butterfly catheter | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| portal vein cannula | |||
| Periphereal Venous Catheter | BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| three-way stopcock | smiths medical | 888-101RE | |
| surgery | |||
| Cotton Sticks | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Cotton Pads | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | 13H118-03 | |
| Gauze Bandage | Hubei Haige Medical Instruments | 14388 | |
| Ringer Solution | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000ml |
| 10ml Syringe | Braun | 4606108V | 10ml/ Luer Solo |
| 5ml Syringe | Braun | 4606061V | 5ml /Luer Solo |
| Suture (Silk 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| medical drape | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | D0613011 | |
| surgical instruments | |||
| needle holder | Geuder | 17570 | |
| micro-forceps | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-scissors | Martin | 11-740-11 | |
| micro-forceps | S&T | 112314 | |
| Clamp | Aesculap | BH111R | |
| scissors | F S T | 14501-14 | |
| surgical forceps | Aesculap | BD 557 | |
| Decellularisation | |||
| Respirator | Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST |
| Perfusion Device | Charite, medical engineering laboratory | custome-made device | decellularisation device |
| peristaltic pump ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | 4-channel |
| heidelberger extension 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA pump-segment | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| CA 2-stopper tube | Pharmed | BPT NSF-51 | |
| bubble trap | custome-made item | ||
| Luer Lock hose connector | Neolab | No. 02-1887 | |
| Detergents | |||
| SDS pellets | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.1 | 10l |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| staining | |||
| Eosin 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxylin | AppliChem | A4840 | |
| gomori staining | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS staining | Morphisto | 11388 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
References
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