Method Article

Mise en œuvre de patch clamp en direct et microscopie de fluorescence pour surveiller propriétés fonctionnelles des fraîchement isolés PKD épithélium

DOI:

10.3791/53035

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September 1st, 2015

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1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

In This Article

Summary

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Les canaux ioniques exprimés dans l'épithélium tubulaire rénal jouent un rôle important dans la pathologie de la maladie polykystique des reins. Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux utilisés pour effectuer l'analyse et le niveau de calcium intracellulaire mesures patch-clamp dans l'épithélium kystique fraîchement isolées à partir de reins de rongeurs.

Abstract

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Cyst initiation et l'expansion au cours de la maladie polykystique des reins est un processus complexe caractérisé par des anomalies dans la prolifération des cellules tubulaire, l'accumulation de fluide luminal et formation de la matrice extracellulaire. L'activité des canaux ioniques et la signalisation intracellulaire de calcium sont des paramètres physiologiques clés qui déterminent les fonctions de l'épithélium tubulaire. Nous avons développé une méthode appropriée pour l'observation en temps réel de l'activité des canaux ioniques avec la technique de patch-clamp et l'enregistrement de Ca2 + intracellulaire niveau dans les monocouches épithéliales fraîchement isolés à partir de kystes rénaux. Rats PCK, un modèle génétique autosomique récessive de la maladie polykystique des reins (ARPKD), ont été utilisés ici pour l'analyse ex vivo de canaux ioniques et des flux de calcium. Décrit ici est une procédure étape par étape détaillé destiné à isoler monocouches kystiques et tubules non dilatée de PCK ou rats normaux Sprague Dawley (SD), et de surveiller l'activité de canal unique et dynamique intracellulaire de Ca2 +.Cette méthode ne nécessite pas de traitement enzymatique et permet une analyse dans un cadre natif de monocouche épithéliale fraîchement isolés. De plus, cette technique est très sensible aux variations de calcium intracellulaire et génère des images à haute résolution pour des mesures précises. Enfin, isolé épithélium kystique peut encore être utilisé pour la coloration avec des anticorps ou des colorants, la préparation des cultures primaires et la purification de différents dosages biochimiques.

Introduction

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Les canaux ioniques jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. Les maladies rénales autosomiques dominants et récessifs polykystiques (PKRAD et PKRAR, respectivement) sont des troubles génétiques caractérisées par le développement de kystes remplis de fluide rénal de l'origine des cellules épithéliales tubulaires. PKD est causée par des mutations de gènes codant pour PKD1 ou PKD2 polycystines 1 et 2, des protéines membranaires impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et la différenciation. PKD2 par lui-même ou sous forme de complexe avec PKD1 fonctionnent éga....

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Protocol

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Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité de soin et l'utilisation institutionnelle animale au Collège médical du Wisconsin et de l'Université du Health Science Center Texas à Houston et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1 montre principales étapes de la séparation des tissus et la procédure de traitement. En bref, les reins des rats PCK ou SD sont utilisés pour l'isolation manuelle de monocouches épithéliales des canaux collecteurs soit de tubes ou des kystes non-composé en bonne santé. Ici, nou....

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Results

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Implication potentielle dans ENaC cystogénèse a été démontrée par de nombreuses études qui observe perturbé le facteur de croissance épidermique (EGF) de signalisation dans la progression PKD 22-25 et la réabsorption du sodium dans anormal ARPKD Les modèles murins et les cultures de tissus 26-28. Par exemple, Veizis et al. Ont montré que l'absorption de Na + sensible à l'amiloride est diminuée dans les cellules CD à partir du modèle de non-orthologue de souris BPK ARPKD 29........

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Discussion

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Nous avons décrit ici applications de la technique de patch-clamp conventionnel et imagerie épifluorescence de calcium à des monocouches épithéliales kystiques dérivées d'un modèle génétique murine de ARPKD. Le protocole se compose de trois étapes, dont la plus grande attention devrait être accordée à l'isolement des kystes (étape 1.5 de la section des protocoles) et les études électrophysiologiques. Ces procédures clés nécessitent une formation approfondie et de patience, et le lecteur ne devrait pas être frust.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Cette étude a été financée par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (à OPO) et K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), l'American Heart Association 13GRNT16220002 (à OPO) et Ben Lipps J. bourse de recherche de l'American Society of Nephrology (DVI).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
Acide pluroniqueSigma-AldrichF-68  ;solution
ShakerBoekel Scientific260350
Source lumineuseSutter Instrument CoLambda XLavec obturateur/pilote de roue à filtres
intégré Filtres à densité neutreNikonND4, ND8
ObjectifNikonSFluo  ;40/1.3 DIC WD 0.22  ;   ; huile
Appareil photoAndor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  ; microscope (inversé)NikonNikon Eclipse TE2000-S
Cover GlassThermo Scientific6661B52
Crayondiamant Fisher Scientific22268912
Logiciel d’acquisition d’imagesNikonNikon NIS-Elements  ;
logiciel d’analyse d’imagesImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Le plugin Utility permet d’importer des images au format natif Nikon Instruments .nd2
Chambre d’enregistrement/de perfusion WarnerInstrumentsRC-26
Patch ClampMolecular Devices
Dispositifs moléculairesDigidata 1440AAxon Digidata® ; Système
Filtre passe-basWarner InstrumentsLPF-88 pôles Bessel
Capillaires en verre borosilicatéWorld Precision Instruments1B150F-4
Extracteur de micropipettesSutter Instrument CoP-97Extracteur de micropipettes de type Flaming/Brown
MicroforgeNarishigeMF-830Japon
MicromanipulateurmotoriséSutter Instrument CoMP-225
Microscope inverséNikonEclipse Ti
Table d’isolation des microvibrationsTMCéquipée d’une cage de Faraday
Système de perfusion de valves multicanauxAutoMake ScientificValve Bank II
Chambre d’enregistrement/de perfusionWarner InstrumentsRC-26
LogicielMolecular DevicespClamp 10 . 2
Table chirurgicale à température contrôlée  ;Noyaupour rongeurs
Stéréomicroscope binoculaireNikonSMZ745
Système de perfusion basé sur une pompe à seringueHarvard Appareil
Tube en polyéthylèneSigma-AldrichPE50
Anesthésie isofluoranehttp://www.vetequip.com/911103
Autres réactifs de baseSigma-Aldrich
Le amplificateur Système d’acquisition de données MultiClamp 700B MCW

References

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  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recess....

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Patch ClampLive Fluorescence MicroscopyPKD EpitheliumIon Channel ActivityIntracellular CalciumCystic Monolayer IsolationElectrophysiology RecordingCalcium ImagingConfocal MicroscopyFluorescent Dye Loading

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