Su ordine Microdialisi Probe design
Summary
Microdialisi è una tecnica comunemente usata nella ricerca delle neuroscienze. Pertanto sonde commerciali sono in gran demand.In questo lavoro un gruppo sonda è spiegato in dettaglio per costruire una concentrica, sonda di microdialisi affidabile, su misura per meno di $ 10.
Abstract
Microdialisi è una tecnica comunemente usata nella ricerca delle neuroscienze. Pertanto sonde commerciali sono molto richiesti per monitorare i cambiamenti fisiologici, farmacologici e patologici nel liquido cerebrospinale. Purtroppo, le sonde commerciali sono costosi per i gruppi di ricerca nelle istituzioni pubbliche. In questo lavoro, un gruppo sonda è spiegato in dettaglio per costruire una concentrica, sonda di microdialisi affidabile, su misura per meno di $ 10. La sonda microdialisi costituito da una membrana in polisulfone con un cut-off molecolare di 30 kDa. Sonda in vitro recuperi di sostanze aventi diverso peso molecolare (nell'intervallo 100-1,600 Da) e diverse proprietà fisico-chimiche sono confrontati. La sonda produce un recupero in vitro di circa il 20% per il piccoli composti glucosio, lattato, acetilcolina e ATP. In vitro recuperi per neuropeptidi con un peso molecolare tra 1.000-1.600 Da pari a 2-6%. Così, mentre il w molecolare superioreotto dei neuropeptidi abbassato de valori di recupero vitro, la dialisi di composti nell'intervallo inferiore (fino a 500 Da) di pesi molecolari non ha grande impatto sul tasso di recupero in vitro. Il presente metodo permette l'utilizzo di una membrana di dialisi con un altro valore di cut-off e materiale della membrana. Pertanto, questo gruppo sonda misura ha il vantaggio di flessibilità sufficiente per dializza sostanze in un ampio intervallo di peso molecolare. Qui, si introduce una sonda microdialisi con una lunghezza scambio di 2 mm, che è applicabile per microdialisi in topo e ratto regioni del cervello. Tuttavia, le dimensioni della sonda possono essere facilmente adattati per lunghezze di cambio più grandi per essere utilizzato in animali più grandi.
Introduction
Microdialisi è una tecnica comunemente usata nella ricerca delle neuroscienze. Nel corso degli ultimi 50 anni, la tecnica della microdialisi minimal-invasiva è stato continuamente migliorato per diventare un metodo consolidato per monitorare le concentrazioni locali di piccole composti con peso molecolare nello spazio extracellulare. Quasi ogni fluido tessuto interstiziale può essere indagato in animali liberi di muoversi.
Gaddum introdotto la tecnica push-pull nel 1960. Ha modificato un approccio da Feldberg et al. In cui tubocurarina stato perfuso attraverso una cannula che termina nel ventricolo laterale e raccolta dell'effluente anche tramite una cannula 1. Gaddum sviluppato la tecnica push-pull in cui una cannula costituito da due aghi acciaio concentrici stato impiantato in aree cerebrali distinte e perfuso con una soluzione contemporaneamente rimuovendo i neurotrasmettitori rilasciati dai neuroni circostanti la punta 2. Purtroppo, dama tessutoge causata dalla cannula attorno alla punta limitato l'applicazione di questo metodo. Come ulteriore avanzamento di questo metodo, Bito e collaboratori hanno introdotto un metodo del sacchetto di dialisi in cui la soluzione raccolta è stato separato dal tessuto circostante da una membrana di dialisi. Hanno impiantato una sacca di dialisi nel tessuto sottocutaneo del collo del cane. Il contenuto del sacchetto dialisi è privo di proteine e può essere analizzato molte settimane più tardi per ioni e aminoacidi 3. Lo sviluppo successivo è stato il dialytrode, una sonda microdialisi primitivo, che in origine era descritto da Delgado nel 1972 4. Infine, Ungerstedt e colleghi hanno migliorato il design della sonda di microdialisi in modo che fosse più piccolo e spostato meno tessuto 5.
Una sonda microdialisi concentrica comporta in modo simile ad un capillare di sangue. Il sistema è costantemente perfuso con una soluzione con la composizione ionica del fluido tessuto circostante mentre manca l'analita di interesse. Thmembrane di dialisi e esposto alla soluzione o tessuto esterno è semi-permeabile. Permette diffusione passiva di sostanze nella sonda lungo il loro gradiente di concentrazione 6. La permeabilità dipende da molte variabili quali il peso molecolare, la forma, carica e pH del composto. Esso è anche limitata a causa delle proprietà del materiale della membrana, dimensioni dei pori della membrana e della portata 7.
Le figure 1 e 2 mostrano una sonda microdialisi concentrica. Il liquido di perfusione entra attraverso un tubo di ingresso nel manicotto metallico, che circonda la silice fusa. All'interno del manicotto metallico, esso flussi giù lungo la silice fusa e lascia sulla sua punta. Nello spazio tra la membrana di dialisi e il politetrafluoroetilene (PTFE) -tubing (come Teflon) il liquido di perfusione fluisce poi verso l'alto. Qui, la diffusione di sostanze dal tessuto si verifica che circondano la membrana. Il dializzato lascia la sonda attraverso il PTFE-tubo, che è collegato alla presa tubo e possono essere raccolti.
La microdialisi ha diversi vantaggi relativi ad altre tecniche in vivo. La sonda costituisce una barriera fisica con la conseguenza che il dializzato contiene enzimi o cellule. Pertanto, non vi è alcuna necessità di purificazione del eluato prima dell'analisi, e nessuna degradazione enzimatica di analiti avviene. Degradazione ossidativa può verificarsi durante il passaggio di analiti nel tubo, ma questo spesso può essere prevenuta con l'aggiunta di un antiossidante (ad esempio acido ascorbico) al perfusato. In alternativa, il danno ossidativo ai neuropeptidi, per esempio, è stato efficacemente soppressa sostituendo il tubo di uscita con una punta per raccogliere il dializzato 8. Il dializzato può essere indagato direttamente con quasi ogni tipo di metodo analitico e più analiti possono essere raccolti simultaneamente. Questo sistema può essere utilizzato in animali svegli, e quasi tutte le regioni del cervello può essereesaminato. Inoltre, l'infusione di farmaci attraverso la sonda è possibile (retrodialysis). Tuttavia, ci sono anche limiti della tecnica microdialisi. La risoluzione temporale un po 'bassa non fornisce informazioni in tempo reale per quanto riguarda i cambiamenti di neurotrasmettitori. Poiché si tratta di una tecnica invasiva, sonda impianto provoca trauma chirurgico e l'anestesia, che può influenzare le concentrazioni di neurotrasmettitori, è necessario in questa fase 7,9,10.
La concentrazione del composto nel dializzato comprende soltanto una piccola quantità di concentrazione del composto effettiva nel fluido extracellulare. Per il calcolo della concentrazione composto sconosciuto nel fluido extracellulare, relativa ripresa in vitro deve essere calcolato. Determinazione dei singoli relativa recuperi vitro per ogni sonda e ogni composto è necessaria prima di iniziare l'esperimento in vivo. A questo scopo, la sonda è immersa in una soluzione contenente ilanalita di interesse, mentre il liquido di perfusione è la stessa soluzione manca l'analita di interesse. Dopo la determinazione delle concentrazioni di composti nel dializzato, questi dati va riferito alla loro concentrazione nel fluido circostante. In vitro determinazioni del recupero di diverse sostanze possono essere implementate contemporaneamente 9.
Molti gruppi di ricerca delle neuroscienze utilizzano la tecnica della microdialisi di indagare neurotrasmettitori e metaboliti nello spazio extracellulare delle aree cerebrali distinte. Pertanto, le sonde commerciali sono molto richiesti nell'ambiente della ricerca neuroscientifica. Un grande vantaggio di sonde disponibili in commercio è l'elevata affidabilità funzionale. Il set-up sperimentale per sonde commerciali è ben consolidata e convalidato per molti neurotrasmettitori e metaboliti noti. Tuttavia, mentre l'apparecchiatura microdialisi in commercio è costoso e ha meno flessibilità di applicazione 11, in thè lavorare un gruppo sonda microdialisi è presentato in dettaglio, che può essere adattato a qualsiasi applicazione e può essere prodotto per meno di $ 10. Questa sonda misura è una sonda microdialisi concentrica testato per le indagini in diverse aree cerebrali 8.
In recuperi sonda vitro di sostanze a diverso peso molecolare (gamma di 100-1,600 Da) e sono confrontati con differenti proprietà chimico-fisiche. In vitro determinazione del recupero del glucosio, lattato e acetilcolina con un peso molecolare inferiore a 200 Da, ATP con un peso molecolare del viene eseguita a circa 500 Da e neuropeptidi angiotensina II, sostanza P e somatostatina con un peso molecolare sopra 1.000 Da.
Protocol
Representative Results
Discussion
La Figura 3 mostra un gruppo sonda esemplare. Correggere le dimensioni interne ed esterne di diametro devono essere strettamente monitorati per tubo (OD 1,6 millimetri; ID 350 micron), silice fusa (OD 105 micron; ID 40 micron) e la membrana di dialisi (OD 245 micron; ID 210 micron). E 'anche importante mantenere uno spazio tra la membrana e silice fusa (105 micron) e tra la membrana e il tubo (105 micron) pure. Se i valori differiscono, la pressione nella sonda può salire e causare perdite della me…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.
Materials
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
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- Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
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- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
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