Summary
Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demand.In neste trabalho um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares.
Abstract
Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demanda para monitorar as mudanças fisiológicas, farmacológicas e patológicos no líquido cefalorraquidiano. Infelizmente, as sondas comerciais são caros para grupos de pesquisa em instituições públicas. Neste trabalho, um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares. A sonda de microdiálise consiste de uma membrana de polissulfona com um corte molecular de 30 kDa. Sonda in vitro recuperações de substâncias com peso molecular diferente (no intervalo de 100-1,600 Da) e diferentes propriedades físico-químicas são comparados. A sonda produz uma recuperação in vitro de aproximadamente 20% para o de glicose compostos pequenos, lactato, acetilcolina e ATP. In vitro recuperações para neuropeptídeos com um peso molecular entre 1,000-1,600 Da quantidade de 2-6%. Assim, enquanto o w molecular mais elevadooito dos neuropeptídeos reduzido em valores de recuperação in vitro, diálise de compostos na gama mais baixa (até 500 Da) de pesos moleculares não tem grande impacto sobre a taxa de recuperação in vitro. O presente método permite a utilização de uma membrana de diálise com o outro valor de cut-off e material de membrana. Portanto, este conjunto de sonda feitos por medida tem a vantagem de flexibilidade suficiente para dialisar substâncias em uma ampla gama de pesos moleculares. Aqui, nós apresentamos uma sonda de microdiálise com um comprimento de permuta de 2 mm, o que é aplicável para microdiálise no rato e regiões do cérebro de rato. No entanto, as dimensões da sonda pode ser facilmente adaptado para comprimentos maiores de câmbio para ser utilizado em animais maiores.
Introduction
Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Durante os últimos 50 anos, a técnica minimamente invasiva de microdiálise foi continuamente melhorado para se tornar um método bem estabelecido para monitorizar as concentrações locais de compostos de pequeno peso molecular, no espaço extracelular. Quase todos os tecidos fluidos intersticiais podem ser investigados em animais que se movem livremente.
Gaddum introduziu a técnica push-pull na década de 1960. Ele modificado a partir de uma abordagem Feldberg et al., Em que tubocurarina foi perfundido através de uma cânula terminando no ventrículo lateral e recolher o efluente também através de uma cânula 1. Gaddum desenvolveu a técnica de push-pull, no qual uma cula que consiste em duas agulhas de aço concêntrico foi implantado em áreas distintas do cérebro e perfundidos por uma solução enquanto se remove simultaneamente os neurotransmissores libertados dos neurónios circundantes da ponta 2. Infelizmente, dama tecidoGE causada pela cânula em torno da ponta limitado a aplicação do presente método. Como um outro avanço deste método, Bito e colaboradores introduziu um método do saco de diálise em que a solução recolhida foi separada a partir do tecido circundante por uma membrana de diálise. Eles implantaram um saco de diálise no tecido subcutâneo do pescoço do cão. O conteúdo do saco de diálise é livre de proteínas e podem ser analisadas várias semanas mais tarde por iões e aminoácidos 3. O seguinte foi o desenvolvimento dialytrode, uma sonda de microdiálise primitiva, que foi originalmente descrito por Delgado em 1972 4. Finalmente, Ungerstedt e colegas melhorado a concepção de sonda de microdiálise, de modo que era menor e menos deslocadas tecido 5.
Uma sonda de microdiálise concêntrica se comporta de forma semelhante a um capilar sangue. O sistema é constantemente perfundidos com uma solução com a composição iónica do fluido do tecido circundante, enquanto a falta de analito de interesse. ºe diálise de membrana exposta à solução externa ou tecido é semi-permeável. Ele permite a difusão passiva de substâncias para a sonda ao longo do seu gradiente de concentração 6. A permeabilidade depende de muitas variáveis tais como o peso molecular, forma, carga e pH do composto. Também é limitada devido às propriedades do material da membrana, o tamanho dos poros da membrana e taxa de fluxo de 7.
As Figuras 1 e 2 mostram uma sonda de microdiálise concêntrica. O fluido de perfusão entra através de uma tubagem de admissão para dentro da manga de metal, que rodeia a sílica fundida. Dentro da luva de metal, ele flui para baixo ao longo da sílica fundida e deixa-o em sua ponta. No espaço entre a membrana de diálise e o politetrafluoroetileno (PTFE) -tubing (tal como teflon) o líquido de perfusão, em seguida, flui para cima. Aqui, a difusão de substâncias a partir do tecido ocorre, que cercam a membrana. O dialisado sai da sonda através da PTFE-tubagem, que está ligada à tomada tubagem e pode ser recolhido.
A técnica de microdiálise tem várias vantagens em relação ao outro em técnicas in vivo. A sonda constitui uma barreira física com o resultado de que o dialisado não contém enzimas ou células. Portanto, não há necessidade de purificação do eluato, antes da análise, e sem degradação enzimática de analitos ocorre. A degradação oxidativa pode ocorrer durante a passagem de analitos no tubo, mas muitas vezes isso pode ser evitado através da adição de um antioxidante (por exemplo, ácido ascórbico) ao perfusato. Alternativamente, o dano oxidativo dos neuropeptídeos, por exemplo, foi suprimido de forma eficiente mediante a substituição do tubo de saída com uma ponta para recolher o dialisado 8. O dialisado pode ser investigado diretamente com quase qualquer tipo de método analítico e vários analitos podem ser coletados simultaneamente. Este sistema pode ser utilizado em animais acordados, e quase todas as regiões do cérebro pode serexaminados. Além disso, a infusão de fármacos através da sonda é possível (retrodiálise). No entanto, também existem limitações da técnica de microdiálise. A resolução um pouco baixa vez não fornece informações em tempo real sobre as alterações de neurotransmissores. Porque é uma técnica invasiva, implantação sonda provoca trauma cirúrgico e anestésico, o que pode afetar as concentrações de neurotransmissores, é necessário durante esta etapa 7,9,10.
A concentração do composto no dialisato compreende apenas uma pequena quantidade de composto de facto a concentração no fluido extracelular. Para o cálculo da concentração do composto desconhecido no fluido extracelular, recuperação relativa in vitro tem de ser calculada. Determinação da relação indivíduo em recuperações in vitro para cada sonda e cada composto é necessário antes de iniciar o experimento in vivo. Para este efeito, a sonda é mergulhado numa solução contendo oanalito de interesse ao passo que o líquido de perfusão é a mesma solução sem o analito de interesse. Após a determinação de concentrações de composto no dialisado, estes dados tem de ser encaminhado para a sua concentração no fluido circundante. In vitro determinações de recuperação de várias substâncias podem ser implementados simultaneamente 9.
Muitos grupos de pesquisa neuroscience usar a técnica de microdiálise para investigar neurotransmissores e metabolitos no espaço extracelular de áreas distintas do cérebro. Assim, as sondas comerciais estão em grande demanda no ambiente de pesquisa em neurociência. Uma grande vantagem das sondas disponíveis comercialmente é a fiabilidade funcional alta. O set-up experimental para sondas comerciais está bem estabelecida e validada por muitos neurotransmissores e metabólitos bem conhecidos. No entanto, ao passo que o equipamento de microdiálise disponível comercialmente é caro e tem menos flexibilidade na aplicação 11, no thtrabalhar é um conjunto de sonda de microdiálise é apresentado em pormenor, o qual pode ser adaptado para qualquer aplicação e pode ser fabricado por menos do que $ 10. Esta sonda feitos sob medida é uma sonda de microdiálise concêntrico testado para investigações em várias áreas do cérebro 8.
Em recuperações sonda in vitro de substâncias com peso molecular diferente (gama de 100-1,600 Da) e com diferentes propriedades físico-químicas são comparados. A determinação in vitro de recuperação de glucose, lactato e acetilcolina com um peso molecular inferior a 200 Da, ATP com um peso molecular de cerca de 500 Da e da neuropeptídeos da angiotensina II, a substância P e de somatostatina com um peso molecular acima de 1.000 Da é realizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
A Figura 3 mostra um conjunto de sonda exemplar. Dimensões de diâmetro interno e externo corretos têm de ser cuidadosamente observados no tubo (OD 1,6 milímetros; ID 350 mm), de sílica fundida (OD 105 mm; ID 40 mm) e membrana de diálise (OD 245 mm; ID 210 mm). É também importante para manter um espaço entre a membrana e de sílica fundida de (105 um) e entre a membrana e os tubos (105 mm), bem. Se os valores forem diferentes, a pressão na sonda pode subir e provocar o vazamento da membrana. </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.
Materials
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
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- Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
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- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
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