Skräddarsydda Microdialysis Probe Design
Summary
Mikrodialys är en ofta använd teknik i neurovetenskaplig forskning. Därför kommersiella sonder är i stort demand.In detta arbete en sondenhet förklaras i detalj för att bygga en pålitlig, koncentrisk, skräddarsydda mikrodialyssond för mindre än $ 10.
Abstract
Mikrodialys är en ofta använd teknik i neurovetenskaplig forskning. Därför kommersiella sonder är i stort behov av att övervaka fysiologiska, farmakologiska och sjukliga förändringar i ryggmärgsvätskan. Tyvärr, kommersiella sonder är dyra för forskargrupper i offentliga institutioner. I detta arbete är en sondenhet förklaras i detalj för att bygga en pålitlig, koncentrisk, skräddarsydda mikrodialyssond för mindre än $ 10. Mikrodialyssonden består av en polysulfon-membran med en molekylär avskiljningsgräns vid 30 kDa. Probe in vitro-återvinningar av ämnen med olika molekylvikt (inom intervallet 100-1,600 Da) och olika fysikalisk-kemiska egenskaper jämförs. Sonden ger ett in vitro återhämtning på cirka 20% för små föreningar glukos, laktat, acetylkolin och ATP. In vitro återkrav för neuropeptider med en molekylvikt mellan 1,000-1,600 Da uppgår till 2-6%. Sålunda, även om högre molekyl wåtta av de neuropeptider sänkas i återvinnings vitro värden, dialys av föreningar i det lägre området (upp till 500 Da) av molekylvikter inte har någon stor inverkan på den in vitro-återvinningsgrad. Föreliggande förfarande tillåter användning av ett dialysmembran med andra cut-off-värde och membranmaterialet. Därför har denna skräddarsydd sondenhet fördelen av tillräcklig flexibilitet för att dialysera ämnen i en bred molekylviktsområde. Här presenterar vi en mikrodialyssond med en utbyteslängd av 2 mm, som är tillämplig för mikrodialys i mus och råtta hjärnregioner. Emellertid kan dimensionerna hos sonden enkelt anpassas för större utbyteslängder som skall användas i större djur.
Introduction
Mikrodialys är en ofta använd teknik i neurovetenskaplig forskning. Under de senaste 50 åren, har minimal-invasiva mikrodialysteknik kontinuerligt förbättras för att bli en väletablerad metod för att övervaka lokala koncentrationer av små molekylvikt föreningar i det extracellulära utrymmet. Nästan varje interstitiell vävnadsvätska kan undersökas i fritt rörliga djur.
Gaddum introducerade push-pull-teknik på 1960-talet. Han ändrade en strategi från Feldberg et al., I vilken tubokurarin perfunderades genom en kanyl som slutar i den laterala ventrikeln och samla utflödet också via en kanyl 1. Gaddum utvecklat tryck-dragteknik i vilken en kanyl bestående av två koncentriska stålnålar implanterades i distinkta områden i hjärnan och perfunderades med en lösning samtidigt avlägsnande av signalsubstanser frisätts från neuronema omger spetsen 2. Olyckligtvis vävnads damaGE orsakas av kanylen runt spetsen begränsat tillämpningen av denna metod. Som ett ytterligare framsteg för denna metod, Bito och medarbetare infört en dialyspåse metod i vilken den uppsamlade lösningen separerades från den omgivande vävnaden genom ett dialysmembran. De implanterade en dialys sac i den subkutana vävnaden av hund halsar. Innehållet i dialyspåsen är proteinfritt och kunde analyseras många veckor senare för joner och aminosyror 3. Nästa utveckling var dialytrode, en primitiv mikrodialyssond, som ursprungligen beskrevs av Delgado 1972 4. Slutligen, Ungerstedt och kollegor förbättrat utformningen av mikrodialys sond så att det var mindre och fördrivna mindre vävnad 5.
En koncentrisk mikrodialyssond beter sig på samma sätt som en blod kapillär. Systemet konstant perfunderas av en lösning med den joniska sammansättningen av den omgivande vävnadsvätska samtidigt som saknar analyten av intresse. The dialysmembran utsätts för extern lösning eller vävnad är semipermeabelt. Det tillåter passiv diffusion av ämnen i sonden längs sin koncentrationsgradient 6. Permeabiliteten beror på många variabler såsom molekylvikt, form, laddning och pH hos föreningen. Den är också begränsad på grund av att egenskaperna hos membranmaterialet, porstorlek av membranet och flödeshastigheten 7.
Figurerna 1 och 2 visar en koncentrisk mikrodialyssond. Perfusionen fluiden kommer in via en inloppsslangen in i metallhylsan, som omger den smält kiseldioxid. Inuti metallhylsa, strömmar ner längs kvartsglas och lämnar den på sin spets. I utrymmet mellan dialysmembranet och polytetrafluoreten (PTFE) -tubing (såsom teflon) strömmar organgenomströmningsfluiden sedan uppåt. Här, diffusion av ämnen från vävnaden uppstår som omger membranet. Dialysatet lämnar sonden genom PTFE-slang, som är ansluten till utloppsslangen och kan uppsamlas.
Mikrodialystekniken har flera fördelar i förhållande till andra in vivo-tekniker. Sonden utgör en fysisk barriär med resultatet att dialysatet inte innehåller några enzymer eller celler. Därför finns det inget behov av rening av eluatet före analys, och ingen enzymatisk nedbrytning av analyter sker. Oxidativ nedbrytning kan inträffa under passagen av analyter i slangen, men detta kan ofta förhindras genom tillsats av en antioxidant (t ex askorbinsyra) till perfusatet. Alternativt, oxidativ skada på neuropeptider, till exempel, var effektivt undertryckas genom att byta ut utloppsröret med en spets för att samla dialysatet 8. Dialysatet kan undersökas direkt med nästan alla typer av analysmetod och flera analyter kan hämtas samtidigt. Detta system kan användas i vakna djur, och nästan alla hjärnregioner kan varaundersökas. Dessutom är infusion av läkemedel genom sonden möjligt (retrodialysis). Det finns emellertid också begränsningar av mikrodialystekniken. Den något låg tidsupplösning ger inte realtidsinformation om signalsubstans förändringar. Eftersom det är en invasiv teknik orsakar sond implantation kirurgiskt trauma och anestesi, vilket kan påverka neurotransmittor koncentrationer krävs under detta steg 7,9,10.
Föreningen koncentrationen i dialysatet innefattar endast en liten mängd av den faktiska föreningen koncentrationen i den extracellulära vätskan. För beräkning av den okända föreningen koncentrationen i den extracellulära vätskan, har relativt in vitro återhämtning ska beräknas. Fastställande av individuella släkting in vitro återvinningar för varje sond och varje förening är nödvändig innan in vivo-experiment. För detta ändamål är sonden doppas i en lösning innehållandeanalyt av intresse medan organgenomströmningsfluiden är samma lösning som saknar analyten av intresse. Efter bestämning av föreningskoncentrationer i dialysatet, dessa data måste hänvisas till deras koncentration i den omgivande vätskan. In vitro utbytesbestämningar av flera ämnen kan genomföras samtidigt 9.
Många neurovetenskap forskargrupper använder mikrodialys teknik för att undersöka neurotransmittorer och metaboliter i det extracellulära utrymmet distinkta områden i hjärnan. Således kommersiella sonder är mycket efterfrågade i neurovetenskap forskningsmiljö. En stor fördel av kommersiellt tillgängliga prober är den höga funktionssäkerhet. Den experimentella set-up för kommersiella prober är väl etablerad och validerats för många kända neurotransmittorer och metaboliter. Men medan den kommersiellt tillgängliga mikrodialys utrustning är dyr och har mindre flexibilitet i tillämpningen 11, i thär arbete en mikrodialyssondenhet presenteras i detalj, som kan anpassas till alla program och kan tillverkas för mindre än $ 10. Denna skräddarsydda sonden är en koncentrisk mikrodialyssond testas för undersökningar i olika områden i hjärnan 8.
In vitro-sond återkrav av ämnen med olika molekylvikt (intervall av 100-1,600 Da) och med olika fysikalisk-kemiska egenskaper jämförs. In vitro återvinning bestämning av glukos, laktat och acetylkolin med en molekylvikt mindre än 200 Da, ATP med en molekylvikt av approximativt 500 Da och den neuropeptider angiotensin II, substans P och somatostatin med en molekylvikt över 1000 Da utförs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Figur 3 visar ett exempel på sondanordningen. Dimensioner Rätt inre och yttre diameter måste observeras noggrant för slang (OD 1,6 mm, ID 350 nm), kvartsglas (OD 105 m; ID 40 pm) och dialysmembran (OD 245 m; ID 210 um). Det är också viktigt att hålla ett utrymme mellan membranet och smält kiseldioxid av (105 | j, m) och mellan membranet och slang (105 | j, m) samt. Om värdena skiljer sig åt, kan trycket i sonden stiga och leda till läckage av membranet.
Här prese…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.
Materials
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
- Ungerstedt, U. Microdialysis–principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1 (2009).
- Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
- Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
- Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).
