मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए पेप्टाइड में ऊतकों और पाचन से बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के संवर्धन
Summary
This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
Abstract
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) ईसीएम कारणों से हृदय सहित विकास में और विविध विकृतियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है सेल प्रसार, अस्तित्व, प्रवास, आदि के प्रमुख नियामकों हैं कि biophysical और जैव रासायनिक संकेतों प्रदान करता है कि पार से जुड़े प्रोटीन की एक जटिल meshwork है और पेशीय-कंकाल रोगों, फाइब्रोसिस, और कैंसर। इस प्रकार, सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों के ECMs की संरचना निस्र्पक उपन्यास शकुन और नैदानिक बायोमार्कर और संभावित उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए ले जा सकता है। हालांकि, ईसीएम प्रोटीन की बहुत प्रकृति (आकार में बड़े पार से जुड़े और covalently बाध्य, भारी ग्लाइकोसिलेटेड) चुनौतीपूर्ण ECMs के जैव रासायनिक विश्लेषण प्रदान की गई है। इस चुनौती पर काबू पाने के लिए, हम ईसीएम प्रोटीन की जटिलता का लाभ लेता है कि ताजा या फ्रोजन ऊतकों और ट्यूमर से ECMs को समृद्ध करने के लिए एक विधि विकसित की है। हम विस्तार से यहाँ अनुक्रमिक मैं के होते हैं कि decellularization प्रक्रिया का वर्णनअलग पीएच और नमक और डिटर्जेंट सांद्रता के buffers में ncubations और कहा कि 1 में परिणाम) इंट्रासेल्युलर (साइटोसोलिक, परमाणु, झिल्ली और cytoskeletal) प्रोटीन और ईसीएम प्रोटीन का 2) संवर्धन की निकासी। हम तो deglycosylate और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए पेप्टाइड में ईसीएम समृद्ध प्रोटीन की तैयारियों को पचाने के लिए क्या करते हैं।
Introduction
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) भाग में, कोशिकाओं और परिभाषित के लिए वास्तु समर्थन और लंगर प्रदान करता है कि पार से लिंक और ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन, ऊतकों 'बायोमैकेनिकल गुण 1,2 की एक जटिल meshwork है। ईसीएम प्रोटीन भी कोशिकाओं को या तो सीधे उनके रिसेप्टर्स (जैसे, integrins, syndecans, आदि) के माध्यम से या 3 संकेत वृद्धि कारक modulating के संकेत। ईसीएम इस प्रकार आदि के प्रसार, अस्तित्व, ध्रुवीकरण, भेदभाव, प्रवास, के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं के प्रमुख नियामकों हैं कि biophysical और जैव रासायनिक संकेतों प्रदान करता है
ईसीएम शरीर क्रिया विज्ञान, विकास और 4 उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, इस तरह के कारणों से हृदय रोग, फाइब्रोसिस, पेशीय-कंकाल रोग, कैंसर, के रूप में कई विकृतियों, के कारण होता है, या, ईसीएम परिवर्तन में परिणाम। इसके अलावा, ईसीएम स्टेम सेल आलों के रखरखाव के लिए योगदान देता है और वें कुंजी ईसीएम अणुओं की पहचानसमर्थन stemness पर ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा 5 में सीधे आवेदन करना होगा। हालांकि, इसके महत्व के बावजूद, ईसीएम रह गया है, हाल ही में जब तक, 6 underexplored।
सिलिको विश्लेषण ईसीएम और ईसीएम जुड़े प्रोटीन के कलाकारों की टुकड़ी के रूप में परिभाषित matrisome, मानव और माउस दोनों जीनोम 1,7,8 में कई सौ जीनों के उत्पादों में शामिल हैं कि पता चला है। हालांकि, ईसीएम प्रोटीन की जटिलता सामान्य और रोग नमूनों के vivo कोशिकी matrices की रचना की व्यवस्थित लक्षण वर्णन रुकावट है। 10 – हम हाल ही में इस जटिलता लाभ के लिए दिया जा सकता है और ईसीएम प्रोटीन 8 को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा है कि प्रदर्शन किया। 10, 13 – हम और दूसरों को आगे मास स्पेक्ट्रोमेट्री ECMs 8 की रचना चिह्नित करने के लिए पसंद का एक तरीका था कि प्रदर्शन किया।
हमयहां विभिन्न पीएच और नमक और डिटर्जेंट सांद्रता के buffers में अनुक्रमिक incubations के होते हैं कि एक decellularization प्रक्रिया का वर्णन। निष्कर्षण (या कमी) साइटोसोलिक, परमाणु, झिल्ली और cytoskeletal प्रोटीन की और ईसीएम प्रोटीन के संवर्धन में इस प्रक्रिया का परिणाम है। हम तो मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए पेप्टाइड में ईसीएम समृद्ध प्रोटीन की तैयारियों को पचाने के लिए क्या करते हैं।
विस्तृत और यहाँ सचित्र प्रक्रियाओं का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक समृद्ध और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विशेषता दस विभिन्न ऊतकों और ट्यूमर प्रकार से कोशिकी मेट्रिसेस है: सामान्य murine फेफड़ों 8, मानव और murine पेट के 8,9, मानव यकृत 9, मानव कोलोरेक्टल ट्यूमर और व्युत्पन्न जिगर metastases 9, मेलेनोमा xenografts 8, (अप्रकाशित नब एट अल।,) स्तन ट्यूमर xenografts 10, murine अग्नाशय टापू और murine insulinomas। अलग matrisom की तुलनातों आगे संभावित निदान या शकुन बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि ऊतक और ट्यूमर विशेष ईसीएम हस्ताक्षरों का पता चला।
हम इस प्रक्रिया नहीं है या अपेक्षाकृत मामूली संशोधनों के साथ अन्य नमूनों को लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संशोधन
हम 8 दस ऊतकों और ट्यूमर प्रकार से ईसीएम को समृद्ध करने के लिए इस सटीक प्रक्रिया कार्यरत हालांकि – 10, प्रोटोकॉल के संशोधनों को निम्नलिखित मामलों में विचार किया जाना चाहिए:
मध्यवर्ती भागों में ईसीएम प्रोटीन का 1) जांच।
फ़ाइब्रोनेक्टिन और laminins के लिए ऊपर चर्चा के रूप में विभिन्न ऊतकों या ट्यूमर प्रकार से कोशिकी मेट्रिसेस, उनके extractability / जटिलता में भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, यह तंतुमय ऊतकों या remodeling के ऊतकों के ईसीएम बहुत गतिशील रूप से खत्म हो जाता है कि ऐसा माना जाता है और इस तरह एक और अधिक आसानी से 12 निष्कर्षण होने के लिए उन ऊतकों में ईसीएम प्रोटीन की एक उच्च अनुपात का निरीक्षण कर सकते हैं। ईसीएम प्रोटीन पाया जाता है, जिसमें अंश के आधार पर हम ईसीएम प्रोटीन की निकासी के कारण या उस कदम को छोड़ते हुए कदम की ऊष्मायन समय को कम करने का सुझाव देते हैं।
2) डीईसीएम समृद्ध गोली में intracellular घटकों का एक महत्वपूर्ण अनुपात की etection। कुछ ऊतकों या ट्यूमर प्रकार के अनुपात कोशिकाओं में: ईसीएम विशेष रूप से उच्च (जैसे, जिगर, तिल्ली, गैर desmoplastic ट्यूमर) है। उस मामले में, (विशेष रूप से cytoskeletal प्रोटीन और / या हिस्टोन में) intracellular प्रोटीन से ईसीएम समृद्ध अंश की एक महत्वपूर्ण संदूषण मनाया जा सकता है। कुशलतापूर्वक, हम बफर एम और / या बफर सीएस (दोनों युक्त डिटर्जेंट, यह आमतौर पर प्रचुर मात्रा में intracellular प्रोटीन depletes) में दो बार ऊष्मायन दोहरा करने का सुझाव intracellular प्रोटीन व्यय करना। एक अन्य विकल्प (अगले पैराग्राफ को देखें) के रूप में यह अच्छी तरह से अपेक्षाकृत अधिक घुलनशील ईसीएम प्रोटीन की कमी को जन्म दे सकती है कि चेतावनी के साथ, उच्च डिटर्जेंट सांद्रता के साथ वैकल्पिक बफ़र्स का उपयोग करने के लिए किया जाएगा।
एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करने के लिए 3) वैकल्पिक।
हम fro buffers की सटीक संरचना प्राप्त करने के लिए, मालिकाना कारणों के लिए, असमर्थ थेपूरक प्रोटीन निष्कर्षण किट के आपूर्तिकर्ता हूँ। हालांकि, हम तालिका में इसी प्रकार के एक्सट्रेक्शन संचालन करने के लिए परिभाषित साबुन के साथ घर का बना बफ़र्स (एनपी-40, सोडियम deoxycholate और एसडीएस) सांद्रता का उपयोग कर अपने स्वयं के अनुभव के आधार पर 1 नोटों को शामिल किया है। हाल के एक अध्ययन में यह भी ईसीएम प्रोटीन 13 बनाए रखने के लिए decellularization बफ़र्स के पीएच के महत्व पर प्रकाश डाला।
तकनीक की सीमाएं
यहाँ प्रस्तुत विधि ईसीएम प्रोटीन आंतरिक रूप से अधिक अघुलनशील सबसे intracellular प्रोटीन की तुलना में कर रहे हैं कि इस तथ्य पर निर्भर करता है। हालांकि, decellularization विधि यहाँ वर्णित निश्चित रूप से इस तरह के कुछ वृद्धि कारकों या ईसीएम-remodeling एंजाइमों के रूप में ईसीएम के भीतर मौजूद घुलनशील घटक निकालता है। के रूप में वर्णित कसकर ईसीएम प्रोटीन के लिए बाध्य ईसीएम जुड़े प्रोटीन तैयार नमूनों में प्रोटिओमिक्स द्वारा पता लगाया गया है, इस पद्धति पूरी तरह से रचना प्रोफ़ाइल करने के लिए भी कठोर हो सकता है matrisome जुड़ेप्रोटीन।
अन्य तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व
मध्यवर्ती कदम छोड़ा जा सकता है या ईसीएम प्रोटीन की हानि को रोकने या क्रमशः intracellular प्रोटीन contaminating की कमी को बढ़ाने के लिए दोहराया: अन्य तरीकों पर यहाँ प्रस्तुत विधि का लाभ यह है कि ब्याज की ईसीएम की प्रकृति के आधार पर किया जा सकता है। इस विधि को भी बाद ही संभव पेप्टाइड तैयारी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ उनके हस्तक्षेप को रोकने के लिए बंद rinsed हैं कि डिटर्जेंट की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करता है। अंत में, पेप्टाइड में ईसीएम युक्त प्रोटीन की तैयारियों को पचाने के लिए यहाँ वर्णित विधि भी प्रोटीन घुलनशील होने के लिए और "कच्चे" ईसीएम समृद्ध भागों पर आयोजित किया जा सकता की जरूरत नहीं है का लाभ दिया है।
(जैसे guanidine हाइड्रोक्लोराइड के रूप में) chaotropes उपयोग वैकल्पिक decellularization विधियों मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ECMs की संरचना का अध्ययन करने के लिए ख हैeen (14 में समीक्षा) साहित्य में सूचना दी और उपास्थि 15,16, दिल 17, स्तन ग्रंथि 18 और नाड़ी 19 और केशिकागुच्छीय 20 तहखाने झिल्ली के ईसीएम रचना चिह्नित करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है।
अनुशंसाएँ
ECMs का विश्लेषण करती है बाद में प्रोटिओमिक्स के लिए समृद्ध कर रहे हैं अगर trypsinization आंशिक ईसीएम पाचन और ईसीएम प्रोटीन और पेप्टाइड्स के नुकसान में परिणाम देगा के रूप में कोशिकाओं बाहर पचाने में ट्रिप्सिन रोजगार Decellularization तरीकों, नहीं किया जाना चाहिए। Collagenase पाचन ऊतक व्यवधान सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहे थे कि यह ईसीएम पाचन और ईसीएम प्रोटीन और पेप्टाइड्स की हानि का कारण बनता है के रूप में इसी तरह, यह सावधानी से नजर रखी जा करने की आवश्यकता होगी।
इन-समाधान बनाम में जेल पाचन? ईसीएम प्रोटीन 3x Laemmli बफर में resuspended जब भी और 100mm डीटीटी, अलग पीओ (6% एसडीएस युक्त),-पार जुड़ा हुआ है और अत्यधिक अघुलनशील हैं औरएसडीएस जैल पर Orly। इस प्रकार में जेल पाचन एक पसंदीदा तरीका नहीं है।
भविष्य अनुप्रयोगों
यह यहाँ पर चर्चा नहीं है, जबकि decellularization के दौरान एकत्र मध्यवर्ती भागों का प्रत्येक की रचना भी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, कि ध्यान देने योग्य है। बहुत छोटे नमूने (यानी, मानव बायोप्सी) या अध्ययन करते हैं तो यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है जानकारी के अन्य सेलुलर भागों पर यात्रा की है।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Materials
| Section 1 | |||
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
| Section 3 | |||
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
| Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |
References
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