Hakket Væv i Komprimeret Collagen: A Cell-holdige Biotransplant for Single-iscenesat rekonstruktionskirurgi Repair

Summary

Tissue engineering omfatter ofte in vitro ekspansion for at skabe autotransplantater til vævsregenerering. I denne undersøgelse blev udviklet en fremgangsmåde til vævsekspansion, regenerering og genopbygning in vivo for at minimere behandlingen af celler og biologiske materialer uden for kroppen.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

De fleste væv engineering undersøgelser om transplantation til huden og urogenitale tarmkanalen omfatter autologe celle høst fra sundt væv og celler ekspansion i særligt udstyrede celle-dyrkning faciliteter ^1,2.

Efter celleekspansion celler sædvanligvis opbevares til senere anvendelse, når patienten er parat til at modtage autograft. Nitrogenholdige frysere tillader langtidsopbevaring ved lave temperaturer på -150 ° C eller lavere. Processen med frysning skal være forsigtig og kontrolleret for ikke at miste cellerne. En risiko for celledød er krystallisering af intracellulær vand under optøningsprocessen, hvilket kan føre til sprængning af cellemembranerne. Celle frysning udføres sædvanligvis ved langsom og kontrolleret afkøling (-1 ° C pr min), ved anvendelse af en høj koncentration af celler, føtalt bovint serum og dimethylsulfoxid. Efter optøning skal bearbejdes igen ved at fjerne frysning medium og dyrkning på cellekultur plast eller et cellernebiomaterialet før transplantation tilbage til patienten.

Alle de ovennævnte trin er tidskrævende, arbejdskrævende og bekostelig ^3. Derudover alle in vitro-behandling af celler beregnet til patient transplantation er stærkt reguleret og kræver veluddannede og akkrediterede personale og laboratorier ^4. Alt i alt, at skaffe en sikker og pålidelig fremstillingsproces, teknikken kunne kun være etableret i et meget lille antal teknisk avancerede centre og en bredere brug i almindelige kirurgiske lidelser er tvivlsomt.

For at overvinde begrænsningerne ved celledyrkning i laboratoriemiljøet er begrebet transplantere hakket væv for celle ekspansion in vivo indført ved hjælp af kroppen selv som en bioreaktor. Til disse formål, vil de autotransplantater fortrinsvis skal transplanteres på et 3D støbeform i overensstemmelse med formen, der er nødvendig ved den endelige rekonstruktion af organet af interest ^5-7.

Oprindeligt var ideen om at transplantere hakket epitel præsenteret af Meek i 1958, da han beskrev, hvordan epitel vokser fra kanterne af et sår. Han påviste, at et lille stykke hud vil øge sine marginer og dermed dens potentiale for celle ekspansion med 100% ved at skære det stykke to gange i vinkelrette retninger (figur 1) ^8. Teorien er blevet støttet af brugen af i indgreb delvise tykkelse hudtransplantationer for hudtransplantation ^{9 og i} huden sårheling modeller ^10.

Figur 1:. Meek teori Ifølge Meek teori, epitel vokser fra kanterne af et sår. Ved at øge området afsløret af hakningen teknologi, hakket væv epithelializes sår fra mange vinkler.

Den foreliggende undersøgelse er baseret på den hypotese, at det samme princip kunne anvendes til det subkutane væv ved at placere hakket epitel omkring en form. Epitelcellerne ville mobilisere fra hakket transplantationer (reorganisere), dække såret områder (migrere) og dividere (udvide) for at danne en kontinuerlig neoepithelium der dækker sårområdet og adskiller fremmedlegeme (formen) fra det indre legeme ( figur 2).

Figur 2:. Tegning af en 3D-form med hakket epitel til in vivo intracorporal vævsekspansion ifølge teorien om Meek Ved at bruge hakket væv anbringes på en form og derefter transplanteres til det subkutane væv, er hypotesen, at epitelcellerne vandrer fra kanter af det hakkede væv, omorganisere og ekspandere for således at danne en kontinuerlig neoepithelium der dækker sårområdet og adskiller fremmedlegeme (formen) fra det indre legeme.

Selvom tidligere in vivo undersøgelser viser lovende resultater, kunne yderligere forbedringer opnås ved at styrke de autotransplantater så regenereret epitel kunne modstå mekanisk traume bedre ^7. Til disse formål, blev vigtige forudsætninger for en vellykket biomateriale identificeret, såsom: let diffusion af næringsstoffer og affaldsprodukter, mulighed for skimmel i en 3D måde og lethed af kirurgisk håndtering. Konklusioner blev foretaget, at disse behov kan opfyldes ved at tilføje et sammensat biomateriale til det hakkede væv.

Den nuværende undersøgelse med henblik på at udvikle et stillads bestående af hakket væv i plast-komprimeret collagen indeholdende en forstærkende kerne af en bionedbrydelig stof. Ved hjælp af disse, kan levedygtige celler migrere fra hakket vævspartikler og proliferere med morfologiske træk er karakteristiske for den oprindelige epitel (hud eller urothelium). Ved hjælp af plast kompression, skafottet var reducered i størrelse fra 1 cm til ca. 420 um som hakket partikler blev indkapslet i det øvre lag collagen. Kernen stof kunne være nogen polymer men skal ændres med en hydrofil overflade for at forbinde med de dækker kollagenlagene ^11.

Den fremgangsmåde, en forbedret stillads integritet ved at indarbejde en strikket maske bestående af poly (ε-caprolacton) (PCL) inden for to plast komprimeret kollagengeler bruger det som et stillads til dyrkning hakket blære slimhinde eller hakket hud fra svin. Konstruktionen blev opretholdt i celledyrkningsbetingelser i op til 6 uger in vitro, hvilket viser vellykket dannelse af en lagdelt, flerlaget urothelium eller squamous hud epitel på toppen af en velkonsolideret hybrid konstruktion. Konstruktionen var let at håndtere og kan sutureres på plads til blære augmentation formål eller dækning af overfladefejl. Alle dele af vævet stillads er FDA-godkendt, og teknikkenkunne anvendes til procedurer ettrins ved vævshøst, hakning, plast kompression, og omplantning tilbage til patienten som en enkelt-iscenesat intervention. Proceduren kan udføres for væv ekspansion og genopbygning under sterile forhold i enhver almen kirurgi enhed.

Protocol

Alle dyr protokoller blev forhåndsgodkendt af Stockholms len Komité for Animals og alle procedurer var i overensstemmelse med reglerne for brug af dyr, samt relevante føderale vedtægter. 1. Animalske Procedurer Klargøring af Animal for Kirurgi Forbered den kirurgiske tabel med alle de materialer og redskaber, der er nødvendige for driften under sterile forhold. Udføre operationen udelukkende under sterile betingelser for at reducere risikoen for infektion og optime…

Representative Results

Denne undersøgelse viser en metode, der viser, hvordan man producerer et biomateriale til transplantation under anvendelse af plast kompression af collagen og hakket væv. Blære slimhinde og hud kan høstes og derefter mekanisk hakket til små partikler (figur 3). Ved plastisk kompression er de hakket partikler inkorporeret i kompositstilladset sammensat af en centralt placeret bionedbrydelig polymer, der er mekanisk stærk i ydre lag af en kollagengel (figur 4).</…

Discussion

Denne undersøgelse viser en let-at-bruge tilgang til frembringelse blærevæggen pletter med autologt væv til transplantation på operationsbordet. Plastrene er dannet ved kombinationen af ​​en biologisk nedbrydelig polymer strikning i midten og kollagen med og uden hakket væv i de ydre overflader i kombination med plast kompression. Plastic komprimering er en metode, der tidligere er beskrevet af andre forfattere og kan defineres som en hurtig uddrivning af fluid fra kollagengeler ^12,13. Hakket væv a…

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3