אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים
Summary
This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.
Abstract
מיקרוסקופיה Intravital היא שיטה שיכול לשמש כדי לחקור תהליכים שונים באזורים שונים וכלי בבעלי חיים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר. זה יכול להתבצע בפרק זמן קצר עם תוצאות לשחזור מראים אינטראקציות יקוציט-האנדותל in vivo. אנו מתארים הגדרה דלקתית לאחר אתגר LPS של האנדותל. אבל במודל זה ניתן להחיל סוגים רבים ושונים של מצבים דלקתיים, כמו חיידקים, כימי או ביולוגי ולחקור את הממשל של תרופות וההשפעות הישירות שלהם על בעלי החיים החיים והשפעתה על גיוס לויקוציטים. פרוטוקול זה יושם בהצלחה למספר הטיפולים השונים של עכברים והשפעתם על תגובה דלקתית בכלי. במסמך זה, אנו מתארים את ההדמיה של לויקוציטים וטסיות דם על ידי fluorescently תיוג אלה עם rhodamine 6G. בנוסף, כל הדמיה ספציפית יכולה להיות PErformed באמצעות מולקולות שכותרתו fluorescently ממוקדות.
Introduction
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקה פשוטה של מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר בחיים עכברים לתצפית ישירה של אינטראקציות יקוציט-האנדותל ויקוציט-טסיות בתנאים דלקתיים.
מיקרוסקופיה Intravital פותחה כדי לחקור אינטראקציות יקוציט-האנדותל in vivo בתנאים דלקתיים 1,2, שאינו טריוויאלי אבל חשוב להבנת גיוס לויקוציטים דלקתי ותפקוד. השיטה שאנו מתארים בפרוטוקול זה פותחה על בסיס פרסומים שפורסמו בעבר. דומה להדמית התאגדות טסיות דם בפקיק גובר 3 ובמקביל למה שפורסם קודם לכן 4, וריד לפדר exteriorized נבחן על ידי מיקרוסקופ אור מועברת. ישנם דגמים שונים של מיקרוסקופיה התוך החיוני כגון שריר Cremaster של חולדות 5 או כבד של עכבר וחולדות 6.
מיקרוסקופיה Intravital של וריד לפדר פותחה ויושמה במחקרים קודמים על ידי מספר קבוצות. השתמשנו בטכניקה זו כדי לצפות בהבדלים בגיוס לויקוציטים בין עכברים הפראיים סוג וhydroxylase1 tryptophane (Tph1) – / – עכברים, שהם לקויים של סרוטונין שאינו עצבי והשווה את הממצאים לעכברי טסיות הדם שסרוטונין היה מדולדל פרמקולוגית על ידי לטווח ארוך פלואוקסטין מעכב יישום ספיגה החוזרת של סרוטונין 7. יש לנו גם בחנו אינטראקציות יקוציט-האנדותל לאחר טיפול פלואוקסטין החריף 8.
בפרוטוקול זה אנו מתמקדים במיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר, כי מודל זה יכול להתבצע במהירות, ומאפשר מדידות תקפות של אינטראקציות יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט. זה הרבה יותר מאתגר ובמיקרוסקופיה intravital של איברים אחרים, כגון עצמות, כבד, עור, או שרירים Cremaster זמן רב. המצבl המתואר כאן הוא אידיאלי להערכה לשחזור של אינטראקציה תאי תאים דלקתית לאחר challengeing אותו עם גירוי דלקתי, כגון זריקת intraperitoneal של lipopolysaccharide.
Protocol
Representative Results
Discussion
במסמך זה אנו מתארים את ההכנה וביצועים של מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר של עכברי in vivo. שיטה זו נותנת לנו את ההזדמנות כדי לבחון אינטראקציות יקוציט-האנדותל וטסיות דם-אנדותל 11 ישירות באורגניזם החי.
כתגובה מוקדמת לדלקת ה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Materials
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
