एक Screenable<em> Vivo</em> ट्रांसजेनिक Bioluminescent का प्रयोग Mitochondrial Modulators के लिए परख<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em
Summary
A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
Abstract
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Introduction
इस प्रक्रिया के समग्र उद्देश्य सी की ऊर्जा स्थिति के तेजी मात्रा का ठहराव है परिसर की जांच में एक समापन बिंदु के रूप में इस का उपयोग करने की दृष्टि से इन विवो में एलिगेंस। औचित्य निमेटोड सी में जुगनू luciferase की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति पर आधारित है प्लाज्मिड pSLGCV (1 के माध्यम से एलिगेंस 1-3 https://www.addgene.org/49862 )। luciferase एंजाइम (संकेत को निशाना luciferase peroxisome हटा दिया गया था) हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP के लिए जुड़े हुए है और कोशिका द्रव्य में अनिवार्यता और सर्वत्र व्यक्त किया है। सब्सट्रेट luciferin exogenously प्रदान की जाती है जब यह प्रकाश उत्सर्जन होता है। कीड़ा पारदर्शी है, प्रकाश के रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों (RLU) के रूप में एक luminometer में मापा जा सकता है। Bioluminescence प्रतिक्रिया और इसकी उपलब्धता सेलुलर एटीपी ईंधन उत्पादित प्रकाश का स्तर निर्धारित करता है। नतीजतन, luminometry एक convenien प्रदान करता हैएटीपी उत्पादन माइटोकॉन्ड्रिया में मुख्य रूप से होता है के बाद से टी, रिश्तेदार एटीपी के स्तर का आकलन करने का और विस्तार माइटोकॉन्ड्रियल समारोह से मतलब है। माइटोकॉन्ड्रियल समारोह और bioluminescence स्तरों के बीच एक कड़ी माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला जीन और सहवर्ती कम हो प्रकाश उत्पादन का मुंह बंद करने के माध्यम से पहले से प्रदर्शन किया गया है। 1
PE254 (feIs4) नामित किया गया उत्पन्न bioluminescence तनाव और PE255 (feIs5) 1 (सामग्री की सूची देखें) और 3। दूसरे के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता अध्ययन का एक नंबर जैसे सोडियम azide 1, कैडमियम 2, सीवेज के रूप में विभिन्न xenobiotic रसायनों के संपर्क में आने के बाद इन विवो में सेलुलर एटीपी के स्तर पर रिपोर्ट करने के लिए इन सेंसर उपभेदों का उपयोग किया है कीचड़ निकालने 3, 5'-फ्लोरो 2-डिऑक्सीयूरिडीन 6, और एक तंबाकू-विशिष्ट nitrosamine 7। उपभेदों भी पराबैंगनी सी विकिरण के लिए जोखिम के प्रभाव पर नजर रखने के लिए उपयोगी किया गया है <sऊपर> 8 और mitochondrial सांस की श्रृंखला समारोह में खलल न डालें का प्रभाव। 1,9 एक GFP संलयन (PE39) के बिना luciferase जीन व्यक्त luminescence सेंसर की एक प्रारंभिक संस्करण भी भारी धातुओं के प्रभाव की जांच में और एक सांस की इस्तेमाल किया गया है । uncoupler 10 खींच PE254 और PE255 luciferase ले: GFP संलयन और GFP प्रतिदीप्ति चमक मूल्यों को सामान्य बनाने के लिए एक सुविधाजनक साधन की पेशकश, निमेटोड जन के साथ आनुपातिक वृद्धि दर्ज की गई थी 6.9 प्रति अच्छी तरह से कीड़े की अंतर राशि का प्रभाव भी हो सकता है। परख (शर्त के अनुसार 5 कुओं की एक न्यूनतम) में कई तकनीकी प्रतिकृति को शामिल करके खाते में ले लिया। 3
प्रोटोकॉल ऊर्जा के स्तर के vivo निगरानी की संभावना प्रदान करता है (के रूप में विरोध करने के लिए और अधिक तकनीकी रूप से थका देने वाली इन विट्रो एटीपी निर्धारण) परिसर स्क्रीनिंग सक्रिय करने के लिए और एक पूरे म्यू के शारीरिक संदर्भ में repositioninglticellular जीव। प्रक्रिया और / या शाही सेना के हस्तक्षेप से जीन मुंह बंद करके उपलब्ध उत्परिवर्ती उपभेदों में chromosomally एकीकृत transgene पार करके आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक किस्म के लिए बढ़ाया जा सकता है; इस प्रकार, सी का पूरा लाभ उठा एक मॉडल के रूप में जीव एलिगेंस। विधि कारण माइटोकॉन्ड्रियल विषाक्तता के लिए दवा उम्मीदवारों की देर चरण विफलता को कम करने और उच्च पशु परीक्षण की कमी की दिशा में एक योगदान करने में मदद करनी चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
मॉडल जीव सी एलिगेंस एक शक्तिशाली प्रायोगिक प्रणाली प्रदान करता है। यह संस्कृति के लिए आसान है और (L4 के माध्यम से किशोर लार्वा चरणों एल 1 के माध्यम से) वयस्क reproducing के लिए अंडे से 3.5 दिन के जीवन चक्र के साथ भरपूर मात्रा में आनुवंशिक रूप से समान संतान पैदा करता है। कारण अपने छोटे आकार के लिए, यह आसानी से यौगिक स्क्रीनिंग की सुविधा, 96 अच्छी तरह प्लेटें में उगाया जा सकता है। हम सी के तनाव के आधार पर एक प्ररूपी स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत एक 96 अच्छी तरह से थाली luminometer और एक बाँझ कैबिनेट की आवश्यकता है, हालांकि ऊर्जा के स्तर के vivo सेंसर के रूप में कार्य है कि एलिगेंस। 14 प्रोटोकॉल, किसी भी प्रयोगशाला के लिए लागू है। यह अच्छा प्रयोगशाला तकनीक का उपयोग करके assays में प्रदूषण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। मैन्युअल काम कर रहे हैं, तो प्राप्त निमेटोड प्लेटों की अधिकतम संख्या 2x 96 अच्छी तरह से दवा प्लेटों के परीक्षण की इजाजत दी और दो वाहन प्लेटों सहित प्रयोग के प्रति 13 है। प्रतिनिधि परिणाम मैं rotenon अवरोध करनेवाला माइटोकॉन्ड्रियल परिसर के लिए प्रस्तुत कर रहे हैंई, सुपरऑक्साइड जनरेटर paraquat, साइट्रिक एसिड चक्र मध्यवर्ती oxaloacetate और ज्ञात जुगनू luciferase निरोधात्मक गतिविधि के साथ चार यौगिकों। oxaloacetate, एक वृद्धि करने के लिए एटीपी के लिए अधिक से अधिक पीढ़ी से परिणाम की संभावना के नेतृत्व जबकि भविष्यवाणी के रूप में पहले दो यौगिकों bioluminescence में कमी करने के लिए नेतृत्व किया। oxaloacetate डेटा सेट में भी एक पत्रकार के रूप में जुगनू luciferase पर आधारित प्रयोगों में आंतरिक परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करता है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों की एक न्यूनतम अज्ञात यौगिकों के लिए प्रतिक्रियाओं की मजबूती का पता लगाने की सलाह दी जाती है।
जुगनू luciferase गतिविधि के निषेध इन विट्रो परख एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर के साथ पहचान योग्य था। 3 यौगिकों में से एक के स्तर को बढ़ाने के अवरोध करनेवाला के साथ संगत GFP प्रतिदीप्ति में पर्याप्त वृद्धि के परिणामस्वरूप GFP टैग luciferase एंजाइम सक्रिय करने के लिए बाध्य द्वारा जुगनू luciferase साइट है, और यह प्रतिपादन अधिक स्थिर है। 15 कुछ उदाहरणों मेंअवरोध करनेवाला अतिरिक्त सब्सट्रेट से विस्थापित किया जाता है जब (नहीं इस विशेष मामले में) इस bioluminescence के स्तर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। 15 अत: यह महत्वपूर्ण जुगनू एंजाइम के साथ बातचीत कि यौगिकों से ग़लती से परिणामों की व्याख्या करने के लिए नहीं है, एटीपी के स्तर में कमी आई है या वृद्धि के रूप में / माइटोकॉन्ड्रियल समारोह। Luminescence संकेत में परिवर्तन अक्सर इस तरह के आंदोलन, विकास और विकास के रूप में स्वास्थ्य के अतिरिक्त माप के साथ संबंध स्थापित। Bioluminescence संकेत में एक नाटकीय गिरावट का पता चला लेकिन कीड़े सूक्ष्म अवलोकन द्वारा नियंत्रण से पृथक कर रहे है, तो एक उदाहरण के रूप में, एक परिसर में एक संदिग्ध luciferase अवरोध करनेवाला है। नहीं विकास या यौगिक autofluorescence द्वारा समझाया GFP प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई है, यह भी एक अवरोध करने के लिए बात कर सकते हैं। Luciferase अवरोधकों 15 के एक नंबर से जाना जाता है और PubChem में दर्ज किया गया है। इसलिए पहले उदाहरण में, यह PubChem द्वारा आयोजित luciferase अवरोधकों के बारे में जानकारी से परामर्श करने के लिए अच्छा अभ्यास है; टी द्वारा पीछाअतिरिक्त साधन द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल समारोह पर प्रभाव का शुद्ध एंजाइम 3 और / या पुष्टि के साथ इन विट्रो assays में यौगिक प्रभाव का esting। 16,17
GFP प्रतिदीप्ति माप जहां संभव bioluminescence के साथ-साथ इस समापन बिंदु को मापने के लिए एक मजबूत मामला बनाने जुगनू luciferase स्तर का पता लगाने के लिए (और ऊपर चर्चा के रूप में कुछ luciferase एंजाइम अवरोधकों की क्षमता का पता लगाने) को सक्रिय करें। GFP के लिए bioluminescence रीडिंग के सामान्यीकरण भी है (यह भी कई तकनीकी प्रतिकृति का समावेश करके प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि) कुओं के बीच कीड़ा संख्या में बदलाव के लिए लेखांकन का एक साधन है। अधिक से अधिक संवेदनशीलता के लिए, यह रीडिंग से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल हालांकि निमेटोड autofluorescence वर्तमान परख की (एक सीमा है, किसी भी उम्र बढ़ने के छात्रों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण के लिए जिम्मेदार नहीं है पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति करने के लिए जीवाणु निलंबन के योगदान का आकलन) उम्र के साथ कि निमेटोड autofluorescence बढ़ जाती दिया मर जाता है। परीक्षण यौगिकों के autofluorescence भी समानांतर में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। शोधकर्ताओं bioluminescence transgene की अभिव्यक्ति के स्तर पर किसी भी तनाव मतभेद के लिए नियंत्रित करने के क्रम में, विभिन्न आनुवंशिक म्यूटेंट में या विभिन्न जीनों के मुंह बंद करने के बाद सेलुलर एटीपी पूल तुलना करने के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए चाहते हैं, जहां GFP के सामान्यीकरण अनिवार्य प्रतीत होता है।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण पैरामीटर जोखिम शुरू की है, जिस पर विकास मंच, जोखिम की लंबाई, और विभिन्न कुओं में नेमाटोड के समान संख्या प्राप्त करने में शामिल हैं। एक्सपोजर हालांकि, नेमाटोड के विकास के किसी भी चरण में एल 3 चरण शुरू कर सकते हैं या पुराने के लिए बेहतर है। MtDNA सामग्री, ऑक्सीजन की खपत और एटीपी के स्तर में एक बहुत ही महत्वपूर्ण वृद्धि के सबूत के रूप में इस स्तर से, नेमाटोड, वयस्कता में विकास के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण पर निर्भर करते हैं। 18,19,20 वर्तमान प्रोटोकॉल एक्सपो शुरू कीL4 मंच पर Ure। (बल्कि वे पहले एल 1 चरण में भोजन के साथ प्रदान किया गया जब से) केवल इस चरण में 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए नेमाटोड aliquoting के लिए कारण, प्लेटें वाष्पीकरण कम करने के लिए नम कक्षों में रखा जाता है, हालांकि, वाष्पीकरण की एक डिग्री अभी भी में होता यह है कि पलकों पर बनाने बहुत छोटी बूंदों के रूप में देखा हमारे मिलाते इनक्यूबेटर, (इसमें दूसरे मिलाते इन्क्यूबेटरों के साथ एक मुद्दा नहीं हो सकता है)। सिर्फ दवा मानकों के अलावा पहले प्लेटों के लिए नेमाटोड aliquoting करके, वास्तविक दवा एकाग्रता वाष्पीकरण के कारण मात्रा में किसी भी छोटे बदलाव से प्रभावित नहीं है। वाहन के साथ एक निमेटोड प्लेट लोड हो रहा है केवल नेमाटोड समान रूप से कुओं के बीच वितरित किया गया है कि जांच करने के लिए उपयोगी है। वाहन ही थाली के लिए पाया किसी भी महत्वपूर्ण मतभेद वेल्स को नेमाटोड वितरण में गरीब तकनीक का संकेत होगा।
जोखिम की लंबाई पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। स्वतंत्र रूप से विकास के लिए ऊर्जा की स्थिति पर प्रभाव हित के समर्थक रहे हैंtocol (उदाहरण के लिए करने के लिए लगभग तत्काल प्रतिक्रिया से, 2 घंटा) कम जोखिम के समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। सी में यौगिकों के दूसरी ओर, प्रविष्टि एलिगेंस ऊतकों में कुछ समय लग सकता है। उदाहरण के लिए 12-24 घंटे resveratrol और 5-फ्लोरो 2'- डिऑक्सीयूरिडीन (FUDR) की अधिकतम आंतरिक सांद्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। 21 इसलिए, एक लंबे समय तक जोखिम (18 घंटा के लिए 24) जोखिम के स्तर को अधिकतम करने के लिए उचित हो सकता है। जोखिम समय प्रजनन के महत्वपूर्ण स्तर कुएं में जगह लेने के लिए अनुमति नहीं है कि समय के लिए सीमित होना चाहिए। हम नेमाटोड की कुल विकास के समय 66-67 घंटे के तहत रखा जाता है कि सलाह देते हैं। हालांकि सुविधाजनक, नेमाटोड तब तक गर्भवती हैं और egglaying शुरू कर दी है। फिर भी हम नगण्य होने के लिए अंडे की तैयारी से bioluminescence रीडिंग पाया () नहीं दिखाया। सुर-5 प्रमोटर संचालित transgene अभिव्यक्ति पहले ही 2-2 और एक आधे घंटे 100 सेल चरण 22 और सी में निषेचन के बाद पता चला हैhitinous खोल luciferin के प्रवेश को सीमित करने की संभावना है। दूसरों embryonated अंडे गर्भवती वयस्कों के चयापचय में महत्वपूर्ण योगदान नहीं किया है कि मिल गया है। 23 बहरहाल, महत्वपूर्ण संतानों के उत्पादन के लिए अनुमति की स्थिति को टाला जा सकता है। अगर पसंद है, प्रयोगात्मक समयमान वेतनमान वापस स्थानांतरित कर दिया जा सकता है: हम पहले से देर L3 लार्वा चरण (36 घंटे) में एक पर्यावरण विष के लिए जोखिम शुरू की और 55 घंटा में bioluminescence और GFP माप बाहर किया है सशर्त बाँझ कर रहे हैं कि 2 वैकल्पिक रूप से, आनुवंशिक पृष्ठभूमि। उदाहरण के फेर-15 (B16) द्वितीय के लिए के रूप में, संतान उत्पादन को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; 15 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है, जो (hc17) चतुर्थ डबल उत्परिवर्ती -1 FEM, लेकिन 25 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ है। 24 बाँझपन प्रेरित करने के लिए FUDR का उपयोग अपने आप में निमेटोड चयापचय को प्रभावित कर सकते हैं इस के रूप में की सिफारिश नहीं है। 25 परख कर सकता है भी इस तरह के आंशिक नुकसान के funct के रूप में अधिक पारगम्य cuticles के साथ उपभेदों में प्रदर्शन कियाबहुऔषध संवेदनशील दवाओं की पारगम्यता वृद्धि के कारण। 26 जो कर रहे हैं आयन बस-8 म्यूटेंट यह कम जोखिम और कम यौगिक सांद्रता की सुविधा होगी। इन नेमाटोड के लिए luciferin जोड़ने के लिए शर्तों में भी चमक बफर में 1% DMSO और 0.05% ट्राइटन X100 luciferin उपलब्धता बढ़ाने के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है, यानी एडजस्ट करने की जरूरत है।
प्रोटोकॉल परिसर में प्रसव के लिए वाहन के रूप में 1% DMSO के उपयोग करता है। हम पिछले एक प्रकाशन में चर्चा की है के रूप में घातक नहीं है, DMSO के इस एकाग्रता कुछ जैविक प्रभाव है। उपलब्ध दवा पुस्तकालयों में से कई 3 वाहन के कमजोर पड़ने के बाद सेल आधारित assays के लिए उपयुक्त होगा कि सांद्रता में, DMSO के 100% में तैयार कर रहे हैं 0.1% करने के लिए। उच्चतर यौगिक सांद्रता सी में प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए आवश्यक हैं एलिगेंस यह कम से कम 1% DMSO पर assays के संचालन करने के लिए अक्सर संभव नहीं है कि इस तरह के मानव कोशिकाओं, के साथ तुलना में। फिर, उपभेदों के उपयोग के साथअधिक पारगम्य cuticles वाहन की कम सांद्रता के साथ परीक्षण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। DMSO के अधिक से अधिक 1% की सांद्रता की सिफारिश नहीं कर रहे हैं।
प्रायर रीडिंग के लिए luciferin के साथ एक सेट ऊष्मायन समय का पालन किया जाना चाहिए। पहले से दिखाया गया है, luminescence अगले 30 मिनट के एक से अधिक चमक में एक धीमी गति से धीरे-धीरे कमी के बाद, luciferin जोड़ने पहले 5 मिनट के लिए अपेक्षाकृत स्थिर रहने के बाद दूसरे मिनट के भीतर अपनी अधिकतम स्तर तक पहुँचता है। एक विशेष रासायनिक करने के लिए काइनेटिक प्रतिक्रियाओं luciferin के प्रारंभिक वितरण के बाद 30 मिनट के इस प्रारंभिक चरण के दौरान किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल निमेटोड आबादी के तुल्यकालन को प्राप्त करने के लिए अंडे के संग्रह के बाद एक भुखमरी कदम शामिल है। विकास के विभिन्न चरणों सेलुलर एटीपी के स्तर में मतभेद है और परीक्षण यौगिकों को अलग तरह से प्रतिक्रिया हो सकती है, क्योंकि हम निमेटोड परीक्षण आबादी के तुल्यकालन सलाह देते हैं। एस पूरा में भुखमरी से बाहर ले जाने सेM9 का विरोध करने के माध्यम के रूप में, अंडे सेने नेमाटोड कि लार्वा को विकसित नहीं है तो, एक कार्बन स्रोत (इथेनॉल) के साथ प्रदान की जाती हैं, लेकिन पूरी तरह से भूखे नहीं हैं। 27,28 यह भी एल 1 गिरफ्तार कर लिया के भोजन के लिए तेजी से प्रतिक्रिया के लिए primed रहे हैं और दिखाया गया है कि सामान्य एल 1 विकास दर को भोजन उपलब्ध हो जाता है के बाद 3 घंटा के भीतर हासिल की है। 29 बहरहाल, यह संभावना भुखमरी कदम सी के चयापचय को बदल सकता है कि एलिगेंस बाहर नहीं किया जा सकता है। भुखमरी की लंबाई 24 घंटा से अधिक नहीं होनी चाहिए इस कारण से 30 (18 घंटा तुल्यकालन के लिए पर्याप्त है)। कुछ प्रयोगशालाओं पूरी तरह भुखमरी कदम दरकिनार उम्र तुल्यकालन के लिए एक Copas Biosorter उपयोग करने की संभावना हो सकती है। अन्य प्रयोगशालाओं से पहले विरंजन के लिए (OP50 साथ एन जी एम प्लेट) ठोस मीडिया पर (कदम 3.1) निमेटोड आबादी के विस्तार के लिए एक प्राथमिकता हो सकती है और यह भी अच्छी तरह से काम करेगा। हम निमेटोड संवर्धन के लिए एक मानक माध्यम है, के रूप में यौगिक प्रदर्शन के दौरान एस माध्यम का उपयोग Howeveआर अन्य मीडिया उदाहरण कश्मीर मध्यम या ईपीए मामूली मेहनत पानी के लिए चुना जा सकता है अक्सर ecotoxicological अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। 31,32
प्रोटोकॉल एक साधन स्क्रीन करने के लिए और mitochondrial समारोह पर प्रभाव के मामले में आगे की जांच के लिए उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए प्रदान करता है। प्राथमिक जांच के स्तर पर यह कुछ यौगिकों इसलिए दवा स्क्रीन संपूर्ण नहीं माना जाना चाहिए, के कारण केवल एक ही एकाग्रता परीक्षण किया जा रहा करने के लिए याद किया गया हो जाएगा संभावना है। हिट्स उदाहरण ऑक्सीजन की खपत, सी के लिए माइटोकॉन्ड्रियल समारोह के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए तकनीक के उपयोग द्वारा मान्य किया जा सकता एलिगेंस GFP व्यक्त माइटोकॉन्ड्रिया के साथ तनाव, mitochondrial झिल्ली क्षमता और / या आरओएस मापन के लिए दाग। 16,33,34 पद्धति का सबसे बड़ा महत्व बहुकोशिकीय जीवधारी स्तर पर यौगिकों और / या शर्तों के बड़ी संख्या में स्क्रीनिंग के लिए एक साधन के लिए है, और महत्वपूर्ण बात वीं का लाभ लेने के लिए सक्षम होने के लिएसी ई आनुवंशिक शिक्षणीयता कार्रवाई के तंत्र की जांच करने के लिए एलिगेंस। तकनीक में तेजी लाने और दिलचस्प यौगिकों और लक्ष्यों की खोज करने के लिए नए रास्ते खोजने के लिए मदद कर सकता है। यह एक बीमारी प्रासंगिक संदर्भ में यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए मानव रोग के साथ जुड़े आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ सेंसर के संयोजन देने के लिए काफी होगा कि परिकल्पना की गई है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Materials
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
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