샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
세포 배양은 전통적 세포가 생체 복부 표면 수용체를 사용하여 부착 BI 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 그러나, 생체 내에서, 대부분의 셀이 완전히 수용체의 3 차원 분포의 결과로, 세포 외 기질 (ECM)에 의해 둘러싸여있다. 이 신호 전달 경로에 외부-따라서 세포 행동의 차이를 유발 할 수 있습니다.
이 문서에서는 이미 새로운 물질 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 2D 기판에 부착 된 세포의 지느러미 수용체를 자극하는 표준 2D 문화에 대한 중요한 변경 사항을 트리거 보여줍니다. 또한, 복부와 지느러미 수용체의 동시 여기 가까이 3D 환경에서 발견에 셀 동작을 이동합니다. 또한 인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 세포 / 재료 INTE 상이한 파라미터들의 연구를 허용 다용도 공구이다ractions, 예를 들어, 지형, 강성과 모두 복부와 등의 측면에서 다른 단백질 코팅. 샌드위치 형 배양액 2D 기판에 기초하기 때문에 최종적으로, 여러 분석 절차는 이미 3D 시스템에 필요한 더 복잡한 절차를 극복 정상적으로 사용할 수있는 표준 2D 배양을 위해 개발.
Introduction
생체 세포의 미세 환경의 대부분은 3 차원 (3D) 성질을 가지고 있지만 전통적으로, 세포 배양 물은 바이 – 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 이 부 자연스러운 2D 환경은 평평한 세계에 스스로 적응하는 방법으로 세포의 행동 변화를 유발하는 직접적인 영향을 세포 운명 1,2. 따라서, 2 차원 세포 배양에서 얻어진 결과는 항상 생체 내에서 재현 할 수 없습니다. 이것은 모든 사이즈 의존성 생물학적기구 3,4-으로 더 통찰력을 얻기 위해 더 많은 생리 같은 조건을 제공하고자하는 새로운 비즈니스 배양 시스템의 개발을 장려하고있다.
2D는 세포 복부 부착 기판 상에 반해 생체 내에서 세포의 대부분이 완전히 ECM에 의해 둘러싸여있다 : 2 차원 배양 및 생체 환경에서 3D 간의 주된 차이점들 중 하나는 세포 외 기질 (ECM)에 고정 세포 수용체의 분포 따라서 CELL 밀착성이 수용체의 3 차원 분포를 통해 발생한다. 이것에 의해 이러한 세포 성장, 세포 분화 및 유전자 발현에 중요한 프로세스를 변조 다른 세포 접착 신호 전달 경로를 트리거한다. 그들의 변동 및 복잡성이 일반적인 세포 배양 과정에서의 표준화를 방해하지만 지난 수십 년 동안, 다양한 3 차원 배양 시스템은 5-8 확립되었다. 또한 3D 시스템은 일반적으로 처리 할 수 및 2D 기판에 현재의 실험 절차는 쉽게 3D 문화 확립 할 수 없습니다 쉽지 않다. 또한, 문헌은 거의 이러한 모델에서 세포 행동의 적절한 이해를 방해하고, 동등한 조건 2D 또는 3D 다른 시스템과 3 차원 배양을 비교하지 않는다.
일단 2D 기판 등의 수용체의 자극에 부착 된 세포를 가진 – 신소재 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 – 셀 모두 응답 3D 환경을 트리거 할 수 있습니다. REA이 뒤에 아들은 지느러미와 복부 수용체 준수와 샌드위치 환경 내에서 확산 (그림 1) 9, 10 두의 동시 활성화입니다. 결과적으로, 세포는 배양 11,12 2D에 대해서 중요한 변화를 겪는다. 등의 자극이 키 세포 경로의 변화를 유발하기 때문에 따라서, 세포의 운명은, 때문에 샌드위치 문화의 조립시 결정됩니다. 따라서, 세포의 운명은 고도로 샌드위치 형 배양 11 조립 시간에 의해 결정된다.
인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 모두 복부 및 등쪽 측면에 같은 화학, 지형, 강성 및 단백질 코팅 같은 셀 / 재료 상호 상이한 파라미터들의 연구를 허용 간단하고 다양한 도구이다. 이는 넓은 V의 독립적 지느러미와 복부 조합에 다른 3D 시스템 (그림 2)에 비해 다양한 기능의 높은 수준을 제공합니다표면 상태의 ariety. 부가 적으로, 다른 세포주 및 배양 샌드위치 형 조립 상이한 시간은 가능성의 넓은 스펙트럼을 증가 연구 될 수있다.
샌드위치 같은 문화의 표준 프로토콜을 사용하여 아래에 자세히 설명되어 하나 등의 기판, 단백질 코팅으로 복부 기판과 피브로넥틴 등의 유리 커버 슬립과 같은 산 (PLLA) 전기 방사 섬유 또는 필름-L-유산 폴리. 샌드위치 같은 문화는 세포 파종 후 또는 2D 문화의 3 시간 후 조립했다. 그러나, 다른 재료 시스템 및 단백질이 사용될 수 있음에 유의 마찬가지로 샌드위치 형상의 배양은 상이한 시점에서 조립 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
요즘, 3D 문화는 암을 포함한 세포 생물학에서 중요한 제약 및 생명 공학 산업을위한 주제뿐만 아니라 연구이고, 줄기 세포. 결과적으로 여러 3 차원 배양 시스템이 개발되어왔다. 불행히도, 3D 시스템 간의 차이는 일반적으로 세포의 운명 이해를 방해하는 다른 셀 동작이 발생할. 또한, 실험 절차는 일반적으로 2D 문화 시스템처럼 간단하지 않다. 따라서, 이들 단점 중 일부는 매우 중요하다 극복하?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
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