In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Summary

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Abstract

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Introduction

La maggior parte delle cellule batteriche sono in grado di utilizzare sia (sessili) le modalità superficiali allegato di crescita ¹ planctonici (senza vita) e. Nella modalità superficie divisoria di crescita, le cellule batteriche secernono e si racchiudono in grandi quantità di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) per formare biofilm. L'EPS consiste principalmente di proteine, DNA extracellulare esopolisaccaride, ed è essenziale per la formazione di biofilm ^2. Serve come un'impalcatura fisico da cui i batteri possono utilizzare per differenziare spazialmente e protegge i batteri da condizioni ambientali nocive e le risposte di accoglienza. Diversi componenti di EPS hanno ruoli distinti nella formazione di biofilm ³ ei cambiamenti nell'espressione di componenti EPS può drammaticamente rimodellare strutture biofilm ^4. Componenti EPS possono anche funzionare come molecole di segnalazione ^5, e studi recenti hanno dimostrato alcuni componenti EPS interagiscono con le cellule microbiche per guidare le loro diff migrazione e biofilmerenziazione ^6-8.

La ricerca sulla EPS è notevolmente avanzato sulla base delle analisi morfologiche del biofilm prodotti da mutanti difettosi in un componente specifico dei EPS ^9,10. Inoltre, l'EPS è generalmente caratterizzato alla macro-scala (caratterizzazione bulk) ^11. Morfologica analizza però può mancare dettaglio quantitativa e la caratterizzazione di massa, che restituisce i valori medi, perde dettaglio che esiste all'interno della eterogeneità del biofilm. Vi è ora una tendenza crescente per avanzare al caratterizzazione in tempo reale delle proprietà meccaniche di EPS in microscala. Questo protocollo dimostra come particella-tracking microrheology è in grado di determinare gli effetti spazio-temporali delle componenti della matrice Pel e esopolisaccaridi Psl sulla viscoelasticità ed efficace reticolazione di Pseudomonas aeruginosa biofilm ^4.

Microrheology passiva è un rh semplice e poco costosoMetodo eology che offre il massimo throughput di campionamento microrheological spaziale di un materiale ad oggi ^12,13. In microrheology passiva, sfere sonda vengono inseriti nel campione e il loro moto browniano, guidato da energie termiche (k _B T) è seguita da microscopio video. Diverse le particelle possono essere monitorati contemporaneamente, e le coordinate dipendenti dal tempo delle particelle seguono un random walk convenzionale. Pertanto, in media, le particelle rimangono nella stessa posizione. Tuttavia, la deviazione standard degli spostamenti o spostamento quadratico medio (MSD) delle particelle, non è zero. Poiché scorrono fluidi viscosi, la particella MSD in un fluido viscoso cresce linearmente con il tempo progredisce. Al contrario, la reticolazione polimerica trovato in viscoelastica o sostanze elastiche aiutare loro di resistere flusso, e particelle diventa limitato nel loro spostamento, portando a plateau nella curva MSD (Figura 1A). Questa osservazione segue la relazione MSDαt <sup> α, dove α è l'esponente diffusiva che è rapporto tra contributi elastici e viscosi della sostanza correlata. Per le particelle si muovono in fluidi viscosi alfa = 1, a sostanze viscoelastiche 0 <α <1, e in sostanze elastiche α = 0. L'MSD può essere utilizzato anche per calcolare l'osservanza creep, che è la tendenza del materiale a deformarsi in modo permanente su tempo e stima quanto facilmente un diffonde materiali.

La chimica dimensioni, la densità e la superficie della particella sono fondamentali per la corretta applicazione delle esperimento microrheological e sono scelti in relazione al sistema studiato (in questo caso i polimeri della matrice biofilm, vedere Figura 1B). In primo luogo, la particella misura la reologia della sostanza con strutture che sono molto più piccola della particella stessa. Se le strutture della sostanza sono di dimensioni simili alla particella, il moto del particolo è perturbata dalla forma e l'orientamento delle singole strutture. Tuttavia, se le strutture circostanti particella sono molto più piccoli, questo effetto è piccola e media, presentando un ambiente omogeneo alla particella (Figura 1B). In secondo luogo, la densità della particella dovrebbe essere simile al mezzo (1,05 g ml ^-1 per mezzi acquosi) in modo che sia evitata la sedimentazione e forze inerziali sono trascurabili. La maggior parte delle particelle con grate di polistirene soddisfano i criteri di cui sopra. Idealmente, la particella non interagisce con i polimeri della matrice biofilm l'interpretazione reologico MSD particella è valido solo se il movimento è casuale, guidata da energia termica e la collisione con strutture sostanza. Ciò può essere osservato controllando se la particella sonda tende a legarsi o rimbalzare la superficie di un biofilm pre-adulto. Tuttavia, nonostante la mancanza di attrazione per il biofilm, le particelle devono essere in grado di essere incorporati nella matrice.Inoltre, l'eterogeneità fisiochimica del biofilm, particelle differenti che sono più adatti come sonde in diverse regioni del biofilm. Così, le particelle di diverse dimensioni e chimica di superficie dovrebbero essere applicati al biofilm.

Come tale, la particella MSD è in grado di fornire utili informazioni su come i diversi componenti contribuiscono alla reologia e la diffusione del biofilm. Inoltre, l'uso di diverse sonde permette di ricavare informazioni sul eterogeneità fisiochimica spaziale del biofilm. Questo metodo può essere utilizzato per testare l'effetto trattamento antimicrobico sulle proprietà meccaniche del biofilm, oppure applicato a biofilm specie miste per studiare come le proprietà meccaniche del biofilm sono cambiati dall'introduzione di un'altra specie. Particle DMS può essere utile anche per la caratterizzazione di biofilm dispersione. Tali studi potrebbero essere utili per la nostra comprensione di biofilm, migliorando potenzialmente trattamenti biofilm unnd ingegnerizzazione di biofilm per le attività utili.

Protocol

1. biofilm Coltivazione Preparazione di ceppi batterici 1 giorno prima coltivazione biofilm, preparare colture batteriche planctonici inoculando 2 ml di adeguato mezzo di crescita di coltura batterica congelato. Utilizzare Luria Broth-mezzo (10 g L -1 NaCl, 10 g di estratto di lievito L -1 e 10 g L -1 triptone) per mucoide P. aeruginosa e le sue Δ pel e Δ PSL mutanti difettosi. Incubare una notte a 200 rpm condizioni scuotendo 37 ° C e. D…

Representative Results

Le proprietà viscoelastiche locali del biofilm nelle diverse regioni del biofilm, che comprendeva i vuoti (media sopra il biofilm), pianure (strato piatto indifferenziata di cellule) e microcolonie (vedi etichette in Figura 2A) sono stati studiati. Le variazioni temporali delle proprietà viscoelastiche del biofilm durante la maturazione da 3 a 5 giorni sono stati determinati. La MSD delle particelle nei vuoti è stato utilizzato come controllo e paragonabile al MSD di particelle in media pura. Al cont…

Discussion

Microrheology è uno strumento utile per misure reologiche locali in sistemi eterogenei, come biofilm microbici. Si tratta di una tecnica non distruttiva, consentendo il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti reologici all'interno dello stesso campione biologico su più punti di tempo. In questo protocollo,-particella monitoraggio microrheology è stato applicato alla Pel e mutanti esopolisaccaridi Psl per indagare come influenzano l'elasticità ed efficace reticolazione della matrice biofilm. PSL favorisce…

Materials

Fluorspheres	Invitrogen	F-8821	1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss		Epifluorescent Microscope
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Peristaltic pump
Flow Cell Chambers	Technical University of Denmark
Bubble Trap	Technical University of Denmark
Silicone Tubing	Dow Corning		3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter
Clear polypropylene plastic connectors	Cole Parmer	06365-83	1/16 in. (1.588 mm)
Binder Clips			To clamp tubing
Coverslips	Thermo Scientific™ Nunc™		50 x 24 mm
Syringe 3 mL	Terumo
27G Needle	Terumo
2L Storage/Media Bottles	VWR®
Trolley			To hold biofilm setup