Protokoll för Tredimensionell Confocal Morfometrisk Analys av Astrocytes

Summary

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Abstract

Som gliaceller i hjärnan, astrocyter har olika funktionella roller i det centrala nervsystemet. I närvaro av skadliga stimuli, astrocyter ändra sina funktionella och strukturella egenskaper, ett tillstånd som kallas reaktiv astroglios. Här är ett protokoll för utvärdering av de morfologiska egenskaperna hos astrocyter presenteras. Detta protokoll omfattar kvantifiering av 12 olika parametrar dvs yta och volym av vävnaden som omfattas av en astrocyternas (astrocyternas territoriet), hela astrocyternas inklusive filialer, cellkroppen och kärnan, samt total längd och antal grenar, intensiteten fluorescens immunreaktivitet av antikroppar som används för astrocyternas detektering och astrocyternas täthet (antal / 1000 pm ^2). För detta ändamål skapades tredimensionella (3D) konfokala mikroskopiska bilder och 3D bildanalys program som Volocity 6,3 användes för mätningar. Råtta hjärnvävnad exponerad för amyloid beta _1-40 </sub> (Ap _1-40) med eller utan en terapeutisk intervention användes för att presentera metoden. Detta protokoll kan också användas för 3D morfometrisk analys av andra celler från antingen in vivo eller in vitro-betingelser.

Introduction

I friska centrala nervsystemet (CNS), astrocyter spelar en viktig roll i regleringen av blodflödet, energimetabolism, synaptisk funktion och plasticitet, och extracellulär jon och signalsubstans homeostas ^1-3. Dessutom astrocyter reagera på olika skadliga stimuli och onormala tillstånd såsom trauma, infektion, ischemi eller neurodegeneration via reaktiv astroglios som kännetecknas av hypertrofi, spridning och funktionell ombyggnad av astrocyter ^4,5.

Reaktiv astroglios kan konstruera det inflammatoriska svaret och reparationsprocess i vävnaden och kan därför påverka den kliniska utfallet av terapeutiska ingrepp. Följaktligen har astrocyter fått uppmärksamhet från neuroforskare under de senaste decennierna som potentiella mål för terapeutiska ingrepp för en rad olika sjukdomar som drabbar centrala nervsystemet.

Astrocyter har normalt en stel form med väl defined grenar som sprider runt soma ^6. I ett sjukdomstillstånd i hjärnan, astrocyternas grenar blir invecklad och visa svullna ändar ^7, till exempel i närvaro av amyloid-beta (AP).

I denna artikel presenteras ett protokoll för att analysera 3D-bilder av astrocyter som förvärvats av konfokalmikroskopi. Tolv olika kvantitativa parametrar för varje astrocyternas mättes: de ytor och volymer av astrocyternas territoriet (vävnaden som omfattas av en astrocyt), hela cellen (inklusive filialer), cellkroppen och kärna; den totala längden och antalet grenar; fluorescensintensiteten hos antikroppar som används för astrocyternas detektering; och tätheten av astrocyter (antal / 1000 ^ m ^2). För detta ändamål har vi använt hjärnsektioner från råttor som exponerats för intrahippocampal injektion av Ap _1-40 med eller utan genistein behandling som en anti-inflammatorisk substans. Den beskrivna protokollet kan användas för morfometrisk enALYS av olika celltyper in vitro eller in vivo i olika förhållanden.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med de riktlinjer som anges i Guide för skötsel och användning av försöksdjur (NIH) har godkänts av Ethic kommitté Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran). 1. Djur, Kirurgi och Prov Förberedelser OBS: Förbered hjärnvävnad för 3D konfokala mikroskopisk analys. Divide djur slumpmässigt in i två grupper: Ap 1-40 -injection (n = 8), och Ap 1-40 -injection med genistein beh…

Representative Results

I detta avsnitt presenteras några exempel på de kvalitativa och kvantitativa observationer som produceras av 3D morfometrisk analys. För fullständiga resultaten av alla 12 parametrar som nämnts tidigare, se vår tidigare offentliggörande 10. Kvalitativa Observationer Astrocyter uppvisade tunna eller tjocka grenar som var oftast lång i Ap 1-40 injicerade råttor (Figur 1). Några små stelformade astrocyter med korta g…

Discussion

I det nuvarande protokollet, använde vi 3D konfokala morfometri att utvärdera 12 olika parametrar som var förknippade med astrocyternas morfologi. För detta ändamål hippocampusvävnad av råttor med Ap _{1-40 –} inducerades astroglios, med eller utan genistein förbehandling som ett anti-inflammatoriskt medel användes. Genom att använda 3D-bilder och morfometrisk programvara, kunde vi visa effekten av genistein på astroglios dvs morfologi astrocyter.

Förändringar …

Materials

Amyloid beta 1-40	Sigma Aldrich	79793	Keep in -70 °C
Genistein	Sigma Aldrich	446-72-0	keep in -20 °C
polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein	DAKO	Z0334
alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies	DAKO
Liquid Permanent Chromogen	DAKO	K0640
Liquid permanent Red Substrate Buffer	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	Polyethoxylated castor oil – Step 1.1
LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
Image Analysis 2000	Tekno Optic
Streotaxic apparatus	Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.