Analyse de<em> Yersinia enterocolitica</em> Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l'aide de bêta-lactamase effecteur Fusions
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
De nombreuses bactéries gram-négatives, y compris pathogène Yersinia spp. Emploient de type III systèmes de sécrétion de translocation des protéines effectrices dans des cellules cibles eucaryotes. A l'intérieur de la cellule hôte les protéines effectrices de manipuler les fonctions cellulaires au profit des bactéries. Pour mieux comprendre le contrôle de sécrétion de type III lors de l'interaction de la cellule hôte, sensible et dosages précis pour mesurer la translocation sont obligatoires. Nous décrivons ici l'application d'un dosage basé sur la fusion d'un fragment de protéine effectrice Yersinia enterocolitica (protéine extérieur Yersinia; YopE). Avec TEM-1 ß-lactamase pour l'analyse quantitative de translocation Le test repose sur le clivage d'une cellule de permeation FRET colorant (CCF4 / AM) par une translocation fusion bêta-lactamase. Après avoir clivé le noyau de Cephalosporine de CCF4 par la bêta-lactamase, de la coumarine FRET est perturbé à la fluorescéine et l'excitation de la fraction de coumarine conduit à l'émission de fluorescence bleue.Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l'analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, dans un modèle de souris. La détection des signaux de fluorescence peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Dans l'installation décrite ici, à la translocation in vitro de fusions effectrices dans des cellules HeLa par des mutants de Yersinia différents est contrôlée par microscopie à balayage laser. Enregistrement conversion intracellulaire de la journaliste de FRET par la bêta-lactamase effecteur fusion en temps réel fournit des résultats quantitatifs robustes. Nous montrons ici des exemples de données, ce qui démontre la translocation accrue par un Y. enterocolitica YopE mutant par rapport à la souche de type sauvage.
Introduction
III systèmes de sécrétion de type sont spécialisés machines protéines exportation utilisées par les différents genres de bactéries gram-négatives de livrer directement des protéines effectrices codées par des bactéries dans les cellules cibles eucaryotes. Bien que la machinerie de sécrétion lui-même est hautement conservée, des ensembles spécialisés de protéines effectrices ont évolué entre les différentes espèces bactériennes à manipuler voies de signalisation cellulaire et faciliter les stratégies de virulence bactériennes spécifiques 1. En cas de Yersinia, jusqu'à sept protéines effectrices, que l'on appelle (protéines extérieures Yersinia) Yops, sont transportés au moment du contact de la cellule hôte et d'agir de concert pour renverser les réponses des cellules immunitaires telles que la phagocytose et la production de cytokines, à savoir, pour permettre la survie extracellulaire des bactéries 2-4. Le processus de translocation est étroitement contrôlée à différents stades 5. Il est établi que l'activation de la SST3 primaire est déclenchée par le contact de la cible thisll 6. Cependant, le mécanisme précis de cette ouverture n'a pas encore été élucidé. Dans Yersinia un deuxième niveau de ce qu'on appelle de réglage fin de la translocation est réalisé par haut ou bas-régulation de l'activité des protéines cellulaires Rho GTP Rac1 ou RhoA. L'activation de Rac1 par exemple invasine ou cytotoxique facteur nécrosante Y (CNF-Y) entraîne une augmentation de la translocation 7-9, tandis que le GAP (GTPase activating protein) fonction de translocation YopE down-régule l'activité Rac1 et diminue en conséquence la translocation par un type de rétroaction négative mécanisme de 10,11.
Méthodes valides et précises sont la condition préalable pour étudier comment la translocation est régulée au cours Yersinia interaction de la cellule hôte. De nombreux systèmes différents ont été utilisés à cet effet, chacune des avantages et des inconvénients spécifiques. Certaines approches reposent sur la lyse de cellules infectées par des bactéries, mais pas différents détergents suivie d'une analyse par transfert de Western. The inconvénient commun de ces méthodes est que la lyse bactérienne mineure mais inévitable contamine éventuellement le lysat cellulaire avec des protéines effectrices bactéries associées. Cependant, le traitement des cellules avec de la protéinase K pour dégrader les protéines effectrices extracellulaires et l'utilisation ultérieure de la digitonine pour la lyse sélective des cellules eucaryotes ont été proposés pour 12 minimiser ce problème. Surtout, ces essais dépendent de façon cruciale sur les anticorps anti-effectrices de haute qualité, qui ne sont généralement pas disponibles dans le commerce. Les tentatives d'utilisation de fusions traductionnelles des protéines effectrices et les protéines fluorescentes comme la GFP pour suivre la translocation ont échoué probablement dû à la structure tertiaire des protéines globulaires fluorescents et l'incapacité de l'appareil de sécrétion de les déplier avant 13 sécrétion. Cependant, plusieurs mots-clés différents rapporteurs comme le cya (calmoduline-dépendante l'adénylate cyclase) domaine de la toxine de Bordetella pertussis cyclolysin 14 ou Flashtag ont été utilisés avec succès pour analyser translocation. Dans le premier essai de l'activité enzymatique de cya est utilisé pour amplifier le signal de la protéine de fusion intracellulaire, tandis que la balise de Flash, une étiquette de motif très court tétracystéine (4Cys), permet pour l'étiquetage avec le colorant de Flash biarsénicale sans perturber le processus de sécrétion 15.
L'approche appliquée ici a été signalé pour la première fois par Charpentier et al., Et est basé sur la conversion intracellulaire de la Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) colorant CCF4 par translocation effecteur TEM-1 bêta-lactamase fusions 16 (figure 1A). CCF4 / AM est un composé de cellules infiltrant dans laquelle un dérivé de la coumarine (donneur) et une fraction de fluorescéine (accepteur) sont reliées par un noyau de céphalosporine. Lors de l'entrée passive dans la cellule eucaryote, la non-estérifié composé fluorescent CCF4 / AM est traitée par les estérases cellulaires au CCF4 chargé et fluorescent et ainsi piégédans la cellule. Excitation de la fraction de coumarine à 405 nm de résultats FRET à la fraction de fluorescéine, qui émet un signal de fluorescence verte à 530 nm. Après clivage du noyau de céphalosporine par la bêta-lactamase FRET est perturbé et l'excitation de la fraction de coumarine conduit à l'émission de fluorescence bleue at460 nm. Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l'analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, la technique a été utilisée dans un modèle d'infection de la souris pour identifier les populations de leucocytes ciblées pour la translocation in vivo 17-19. Compteur de signaux peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Il faut noter que le procédé prévoit également la possibilité de contrôler la translocation en temps réel par microscopie des cellules vivantes au cours de la 20,21 processus de l'infection. Ici, la microscopie par fluorescence à balayage laser a été appliquée pour readout des signaux de fluorescence comme il offre la plus élevée sensibilité et la précision. En particulier, la capacité d'ajuster la fenêtre d'émission avec une précision nanométrique en combinaison avec des détecteurs de haute sensibles facilite optimisé détection par fluorescence et minimisé la diaphonie. En outre, cette configuration de microscopie peut être adapté pour la surveillance en temps réel de la translocation et permet potentiellement pour l'analyse simultanée de interaction hôte-pathogène au niveau cellulaire.
Dans cette étude, les taux d'un Y. de translocation enterocolitica souche de type sauvage et un mutant de deletion YopE présentant un phénotype de hypertranslocator 10,11 ont été analysés de manière exemplaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous ici appliqué avec succès un essai à base TEM-1 bêta-lactamase reporter pour l'analyse quantitative des effecteur translocation par Y. enterocolitica. De nombreuses variantes de cette technique sensible, spécifique et relativement simple ont été décrits dans la littérature. Dans cette étude, la microscopie à balayage laser a été réalisée pour la détection plus sensible et précise de signaux de fluorescence. Plus précisément, la correction de diaphonie entre les colorants donn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
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