Analisi di<em> Yersinia enterocolitica</em> Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
Molti batteri gram-negativi, tra cui patogeno Yersinia spp. Impiegano tipo III sistemi di secrezione di traslocare le proteine effettrici all'interno delle cellule bersaglio eucariotiche. All'interno della cellula ospite proteine effettrici manipolare funzioni cellulari a beneficio dei batteri. Per meglio comprendere il controllo di tipo III secrezione durante l'interazione cellula ospite, dosaggi precisi e sensibile per misurare la traslocazione sono obbligatori. Abbiamo qui descriviamo l'applicazione di un saggio basato sulla fusione di un frammento di proteina effettore Yersinia enterocolitica (Yersinia proteina esterna; YopE). Con TEM-1 beta-lattamasi di analisi quantitativa di traslocazione Il test si basa sulla scissione di una cella permeante FRET dye (CCF4 / AM) da traslocata fusione di beta-lattamasi. Dopo la scissione del nucleo cefalosporine CCF4 dalla beta-lattamasi, FRET da cumarina a fluoresceina viene interrotto e l'eccitazione della porzione cumarina porta a blu emissione di fluorescenza.Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e de vivo anche, ad esempio, in un modello di topo. Rilevazione dei segnali di fluorescenza può essere eseguita utilizzando lettori di piastre, analisi FACS o microscopia a fluorescenza. Nella configurazione descritta qui, in vitro traslocazione di fusioni effettrici in cellule HeLa da diversi mutanti Yersinia è monitorato mediante microscopia a scansione laser. Registrazione conversione intracellulare del reporter FRET dalla beta-lattamasi effettori fusione in tempo reale fornisce risultati quantitativi affidabili. Siamo qui Mostriamo dati esemplificativi, dimostrando una maggiore traslocazione da un Y. enterocolitica YopE mutante rispetto al ceppo selvatico.
Introduction
III sistemi di secrezione di tipo sono macchine proteina-export specializzata utilizzati da diversi generi di batteri gram-negativi per fornire direttamente le proteine effettrici batteri codificate all'interno delle cellule bersaglio eucariotiche. Mentre il meccanismo secretorio stessa è altamente conservata, insiemi specializzati di proteine effettrici sono evoluti tra le diverse specie batteriche per manipolare percorsi di segnalazione cellulare e facilitare specifiche strategie di virulenza batterica 1. In caso di Yersinia, fino a sette proteine effettrici, i cosiddetti (proteine esterne Yersinia) YOPS, sono traslocato al contatto della cellula ospite e agire insieme per sovvertire le risposte delle cellule immunitarie come la fagocitosi e la produzione di citochine, vale a dire, per permettere la sopravvivenza extracellulare dei batteri 2-4. Il processo di traslocazione è strettamente controllata in diverse fasi 5. E 'stabilito che l'attivazione primaria del T3SS è innescata dal suo contatto con il ce bersaglioll 6. Tuttavia, il meccanismo preciso di questa iniziazione deve ancora essere chiarito. In Yersinia un secondo livello di cosiddetta messa a punto di traslocazione si ottiene up- o down-regolare l'attività delle proteine cellulari Rho GTP-binding Rac1 o RhoA. L'attivazione di Rac1 ad esempio invasina o citotossico necrotizzante fattore Y (CNF-Y) porta ad un aumento traslocazione 7-9, mentre la funzione del GAP traslocato YopE (GTPasi attivando proteina) down-regola l'attività Rac1 e diminuisce di conseguenza traslocazione da un tipo di feedback negativo Meccanismo di 10,11.
Metodi validi e precisi sono il presupposto per indagare come traslocazione è regolata durante l'interazione cellula ospite Yersinia. Molti sistemi differenti sono stati utilizzati per questo scopo, ciascuno con vantaggi e svantaggi specifici. Alcuni approcci si basano su lisi delle cellule infette, ma non i batteri da diversi detergenti seguita da western blot. The svantaggio comune di questi metodi è che la lisi batterica minore ma potenzialmente inevitabile contamina il lisato cellulare con batteri associati proteine effettrici. Tuttavia, il trattamento di cellule con proteinasi K per degradare proteine effettrici extracellulari e successivo utilizzo di digitonina per lisi selettiva delle cellule eucariotiche sono state proposte per minimizzare questo problema 12. È importante sottolineare che questi test cruciale dipendono anticorpi anti-effector alta qualità, che non sono per lo più disponibili in commercio. I tentativi di utilizzare fusioni traduzionali delle proteine effettrici e proteine fluorescenti come la GFP per monitorare traslocazione non hanno avuto successo probabilmente a causa della struttura terziaria delle proteine globulari fluorescenti e l'incapacità dell'apparato di secrezione a svolgersi prima secrezione 13. Tuttavia, diverse etichette giornalista diversi, come il cya (calmodulina-dipendente ciclasi) dominio del tossina della pertosse Bordetella cyclolysin 14 o Flashtag sono stati utilizzati con successo per analizzare traslocazione. Nel primo saggio di attività enzimatica di cya viene utilizzato per amplificare il segnale della proteina di fusione intracellulare, mentre il tag Flash, un tag brevissimo tetracysteine (4Cys) motivo, permette per l'etichettatura con il colorante Flash biarsenical senza disturbare il processo della secrezione 15.
L'approccio applicato qui è stato riportato per la prima volta da Charpentier et al. E si basa sulla conversione intracellulare del Förster Resonance Energy Transfer (FRET) dye CCF4 da traslocati effettore TEM-1 beta-lattamasi fusioni 16 (Figura 1A). CCF4 / AM è un composto cellulare permeanti in cui un derivato cumarina (donatore) e un residuo fluoresceina (accettore) sono collegati da un nucleo cefalosporina. All'entrata passivo nella cellula eucariotica, il non fluorescente esterificati composto CCF4 / AM viene elaborato dalle esterasi cellulari per il CCF4 carica e fluorescente e quindi intrappolatoall'interno della cellula. Eccitazione della porzione cumarina a 405 nm risultati in FRET alla frazione fluoresceina, che emette un segnale di fluorescenza verde a 530 nm. Dopo la scissione del nucleo cefalosporina dal FRET beta-lattamasi è interrotto e l'eccitazione della porzione cumarina porta a blu fluorescenza at460 nm. Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, la tecnica è stata utilizzata in un modello di infezione mouse per individuare le popolazioni leucocitarie mirati per traslocazione in vivo 17-19. Lettura dei segnali può essere condotta utilizzando lettori di piastre, FACS o microscopia a fluorescenza. Da notare, il metodo prevede anche la possibilità di monitorare traslocazione in tempo reale mediante microscopia live-cellulare durante il processo di infezione 20,21. Qui microscopia a scansione laser a fluorescenza è stato applicato per readout di segnali di fluorescenza in quanto fornisce massima sensibilità e precisione. In particolare, la capacità di regolare la finestra di emissione con precisione nanometrica in combinazione con rivelatori ad alta sensibili facilita ottimizzato rivelazione a fluorescenza e minimizzato cross-talk. Inoltre questa configurazione microscopia può essere adattato per il monitoraggio in tempo reale di traslocazione e potenzialmente consente per l'analisi simultanea di interazione ospite-patogeno a livello cellulare.
In questo studio i tassi di traslocazione di un Y. enterocolitica ceppo selvatico e una delezione mutante YopE esibendo un fenotipo hypertranslocator 10,11 sono stati analizzati in modo esemplare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siamo qui applicato con successo un saggio basato TEM-1 beta-lattamasi giornalista per l'analisi quantitativa dei effettori traslocazione di Y. enterocolitica. Molte diverse varianti di questa tecnica sensibile, specifico e relativamente semplice sono state descritte in letteratura. In questo studio microscopia a scansione laser è stato condotto per il rilevamento più sensibile e preciso dei segnali di fluorescenza. Specificamente la correzione per diafonia tra i coloranti donatore e accettore e …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
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