Analyse av<em> Yersinia enterocolitica</em> Effector Translokasjon i vertsceller Bruke Beta-laktamase Effector Fusions
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
Mange gram-negative bakterier, inkludert patogene Yersinia spp. Anvende type III sekresjons-systemer for å translocate effektor proteiner i eukaryote målceller. Inne i vertscellen effektorcellene proteinene manipulere cellefunksjoner til fordel for bakterier. For bedre å forstå kontroll av type III sekresjon i løpet av vertscelleinteraksjon, følsomme og nøyaktige analyser for å måle trans er nødvendig. Vi her beskriver anvendelsen av en analyse basert på fusjon av et Yersinia enterocolitica effektor proteinfragment (Yersinia ytre protein, YopE). Med TEM-1 beta-laktamase for kvantitativ analyse av trans Analysen baserer seg på spaltning av en celle permeant FRET fargestoff (CCF4 / AM) ved translokert beta-laktamase fusjon. Etter spalting av cefalosporin-kjernen CCF4 av beta-laktamase, FRET fra coumarin til fluorescein er forstyrret, og magnetisering av kumarin-delen fører til blå fluorescens emisjon.Ulike anvendelser av denne fremgangsmåte er blitt beskrevet i litteraturen fremheve dens allsidighet. Fremgangsmåten gjør det mulig for analyse av trans in vitro og også in in vivo, for eksempel i en musemodell. Påvisning av fluorescens-signaler kan utføres ved hjelp av platelesere, FACS-analyse eller fluorescens mikroskopi. I oppsettet er beskrevet her, in vitro translokasjon av effektor fusjoner i HeLa celler ved ulike Yersinia mutanter overvåkes av laser scanning mikroskopi. Opptak av intracellulær omdanning av FRET reporter av beta-laktamase effektor fusjon i sanntid gir robuste kvantitative resultater. Vi her viser eksemplarisk data, som viser økt translokasjon av en Y. enterocolitica YopE mutant, sammenlignet med villtypestammen.
Introduction
Type III sekresjons-systemer er spesialiserte protein-eksport maskiner benyttes av forskjellige slekter av gram-negative bakterier for direkte å levere bakterielt kodet effektor proteiner i eukaryote målceller. Mens utskillelsen maskiner selv er svært konservert, har spesialiserte sett av effektor proteiner utviklet seg mellom de ulike bakteriearter å manipulere cellulære signalveier og tilrettelegge spesifikke bakterie virulens strategier 1. Ved Yersinia, opp til syv effektor proteiner, såkalte Yops (Yersinia ytre proteiner), blir translokert over vertscellekontakt og virker sammen for å styrte immun celle responser som fagocytose og cytokin produksjon, dvs. å tillate ekstracellulære overlevelse av bakterier 2-4. Prosessen med å trans blir kontrollert på forskjellige stadier 5. Det er fastslått at primære aktivering av T3SS utløses ved sin kontakt til målet cell 6. Imidlertid er den nøyaktige mekanismen for denne initiering som ennå ikke er klarlagt. I Yersinia et annet nivå av såkalte finjustering av trans oppnås ved opp- eller ned-regulere aktiviteten av mobiltelefon Rho GTP-bindende proteiner Rac1 eller RhoA. Aktivering av Rac1 eksempel ved invasin eller cytotoksisk nekrotiserende faktor Y (CNF-Y) fører til økt trans 7-9, mens GAP (GTPase-aktiverende protein) funksjon translokert YopE nedregulerer Rac1 aktivitet og følgelig reduserer translokasjon av en negativ feedback-typen mekanisme 10,11.
Gyldige og presise metoder er en forutsetning for å undersøke hvordan translokasjon er regulert under Yersinia vertscelleinteraksjon. Mange forskjellige systemer har vært brukt for dette formål, hver med spesielle fordeler og ulemper. Noen metoder er avhengige av lysering av infiserte celler, men ikke bakterier av forskjellige vaskemidler, etterfulgt av western blot analyse. The felles ulempe ved disse metodene er at små, men uunngåelige bakteriell lysis potensielt forurenser cellelysatet med bakterie tilhørende effektor-proteiner. Imidlertid behandling av cellene med proteinase K for å degradere ekstracellulære effektor proteiner og påfølgende bruk av digitonin for selektiv lysis av cellen som ble foreslått for å redusere dette problemet 12. Viktigere, disse analysene avgjørende avhenge av høy kvalitet anti-effektor antistoffer, som stort sett ikke er kommersielt tilgjengelig. Forsøk på å bruke translasjonelle fusjoner av effektor-proteiner og fluorescerende proteiner som GFP å overvåke trans var ikke vellykket, sannsynligvis på grunn av det kuleformede tertiære strukturen til de fluorescerende proteiner og manglende evne til sekresjon apparat for å brette dem før sekresjon 13. Men flere forskjellige reporter tags som cya (kalmodulin avhengig adenylatsyklase) domenet av Bordetella pertussis toksin cyclolysin 14 eller Flashtag ble med hell anvendt for å analysere translokasjon. I det førstnevnte assay den enzymatiske aktiviteten til cya blir brukt til å forsterke signalet fra den intracellulære fusjonsproteinet, mens Flash-koden, en meget kort tetracysteine (4Cys) motivet tag, gjør det mulig for merking med biarsenical fargestoff Flash uten å forstyrre prosessen med sekresjon 15.
Tilnærmingen anvendt her ble rapportert for første gang av Charpentier et al., Og er basert på den intracellulære omdannelsen av Förster resonans energioverføring (FRET) fargestoff CCF4 av translokerte effektor TEM-1 beta-laktamase-fusjoner 16 (figur 1A). CCF4 / AM er en celle-permeant forbindelse hvori en kumarin derivat (donor) og en fluorescein-del (akseptor) er forbundet med en cefalosporin-kjernen. Ved passiv inntreden i eukaryote cellen, er den ikke-fluorescerende forestret CCF4 / AM forbindelse behandles av cellulære esteraser til ladet og fluorescerende CCF4 og dermed fangeti cellen. Eksitasjon av kumarin-delen ved 405 nm resulterer i FRET til fluorescein del, som avgir et signal grønn fluorescens ved 530 nm. Etter spaltning av cefalosporin-kjernen ved hjelp av beta-laktamase FRET er forstyrret, og magnetisering av kumarin-delen fører til blå fluorescens emisjon at460 nm. Ulike anvendelser av denne fremgangsmåte er blitt beskrevet i litteraturen fremheve dens allsidighet. Fremgangsmåten gjør det mulig for analyse av trans in vitro og også in in vivo, for eksempel, ble den teknikk som brukes i et museinfeksjonsmodell for å identifisere de leukocyttpopulasjoner målrettet for trans in vivo 17-19. Utlesning av signaler kan utføres ved å bruke platelesere, FACS-analyse eller fluorescens mikroskopi. Av notatet, gir metoden også muligheten til å overvåke translokasjon i sanntid av levende celle mikros under infeksjonen prosessen 20,21. Her laser scanning fluorescens mikroskopi ble søkt om readout av fluorescens-signaler som det gir høy følsomhet og nøyaktighet. Spesielt, evnen til å justere utslipps vindu med nanometerpresisjon i kombinasjon med høy følsomme detektorer muliggjør optimalisert fluorescensdeteksjon og minimeres krysstale. I tillegg denne mikros oppsettet kan tilpasses for sanntids overvåking av translokasjon og potensielt tillater for simultan analyse av vert-patogen interaksjoner på cellenivå.
I denne studien trans priser av en Y. enterocolitica vill type belastning og en YopE sletting mutant stille en hypertranslocator fenotype 10,11 ble exemplarily analysert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi her vellykket anvendt et TEM-1 beta-laktamase reporter basert assay for kvantitativ analyse av effektoren translokasjon av Y. enterocolitica. Mange forskjellige varianter av denne sensitive, spesifikke og relativt enkel teknikk som er blitt beskrevet i litteraturen. I denne studien laser scanning mikroskopi ble utført for mest følsom og nøyaktig påvisning av fluorescens-signaler. Spesielt korreksjon for krysstale mellom donor og akseptor fargestoffer og de individuelt justerbare deteksjonsbåndb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
