Análisis de<em> Yersinia enterocolitica</em> Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
Muchas bacterias gram-negativas, incluyendo patógenos Yersinia spp. Emplean tipo III sistemas de secreción de trasladar proteínas efectoras en células diana eucariotas. Dentro de la célula huésped proteínas efectoras manipular las funciones celulares en beneficio de las bacterias. Para comprender mejor el control de la secreción de tipo III durante la interacción célula huésped, sensible y ensayos precisos para medir la translocación son obligatorios. Se describen la aplicación de un ensayo basado en la fusión de un fragmento de proteína efectora Yersinia enterocolitica (proteína externa Yersinia; YopE). Con TEM-1 beta-lactamasa para el análisis cuantitativo de la translocación El ensayo se basa en la escisión de una célula permeante FRET de colorante (CCF4 / AM) translocado por fusión beta-lactamasa. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina de CCF4 por la beta-lactamasa, FRET de cumarina a la fluoresceína se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul.Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, en un modelo de ratón. La detección de las señales de fluorescencia se puede realizar utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. En la configuración descrita aquí, en la translocación vitro de fusiones efectoras en células HeLa por diferentes mutantes Yersinia es supervisado por microscopía de barrido láser. Grabación de la conversión intracelular de la reportero FRET por el efector de fusión beta-lactamasa en tiempo real proporciona resultados cuantitativos robustos. Aquí mostramos los datos de ejemplares, lo que demuestra una mayor translocación por una Y. enterocolitica YopE mutante en comparación con la cepa de tipo salvaje.
Introduction
Tipo III sistemas de secreción son máquinas especializadas proteína de exportación utilizados por diferentes géneros de bacterias gram-negativas para entregar directamente proteínas efectoras bacterias codificados en las células diana eucariotas. Mientras que la maquinaria de secreción en sí está altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras han evolucionado entre las diferentes especies bacterianas para manipular vías de señalización celular y facilitar estrategias de virulencia bacterianas específicas 1. En caso de Yersinia, hasta siete proteínas efectoras, llamados (proteínas externas de Yersinia) Yops, se translocan al entrar en contacto la célula huésped y actuar conjuntamente para subvertir las respuestas de células inmunes tales como la fagocitosis y producción de citoquinas, es decir, para permitir la supervivencia extracelular de las bacterias 2-4. El proceso de translocación está estrechamente controlada en las diferentes etapas 5. Se establece que la activación primaria de la T3SS se desencadena por su contacto con el ce objetivoll 6. Sin embargo, el mecanismo exacto de esta iniciación aún no se ha dilucidado. En Yersinia un segundo nivel de la llamada puesta a punto de la translocación se consigue altura o baja regulación de la actividad de las proteínas celulares Rho GTP vinculante Rac1 o RhoA. La activación de Rac1 por ejemplo invasina o citotóxico del factor necrosante Y (CNF-Y) conduce a una mayor translocación 7-9, mientras que el GAP (proteína activadora de GTPasa) Función de translocado YopE abajo-regula la actividad de Rac1 y en consecuencia disminuye la translocación por un tipo de retroalimentación negativa de mecanismo de 10,11.
Métodos válidos y precisos son el requisito previo para investigar cómo se regula la translocación durante la interacción célula huésped Yersinia. Muchos sistemas diferentes se han utilizado para este propósito, cada uno con ventajas y desventajas específicas. Algunos enfoques se basan en la lisis de las células infectadas pero no bacterias por diferentes detergentes seguido por análisis de transferencia Western. The inconveniente común de estos métodos es que la lisis bacteriana menor pero inevitable potencialmente contamina el lisado celular con proteínas efectoras bacterias asociadas. Sin embargo, se propusieron tratamiento de células con proteinasa K para degradar las proteínas efectoras extracelulares y uso posterior de digitonina para la lisis selectiva de las células eucariotas para minimizar este problema 12. Es importante destacar que estos ensayos dependen crucialmente anticuerpos anti-efectoras de alta calidad, que en su mayoría no están disponibles comercialmente. Los intentos de utilizar fusiones traduccionales de las proteínas efectoras y las proteínas fluorescentes como GFP para controlar la translocación no tuvieron éxito debido probablemente a la estructura terciaria globular de las proteínas fluorescentes y la incapacidad del aparato de secreción a desplegarse antes de la secreción de 13. Sin embargo, varias etiquetas diferentes reportero como el cya (calmodulina dependiente adenilato ciclasa) dominio de la toxina Bordetella pertussis cyclolysin 14 o Flashetiqueta se utiliza con éxito para analizar la translocación. En el primer ensayo se usa la actividad enzimática de cya para amplificar la señal de la proteína de fusión intracelular, mientras que la etiqueta Flash, un tiempo muy corto de tetracisteína (4Cys) tag motivo, permite el etiquetado con el flash colorante biarsénico sin perturbar el proceso de la secreción 15.
El enfoque aplicado aquí se informó por primera vez por Charpentier et al., Y se basa en la conversión intracelular de la transferencia de energía de resonancia Förster (FRET) colorante CCF4 por translocados efector TEM-1 beta-lactamasa fusiones 16 (Figura 1A). CCF4 / AM es un compuesto de células permeante en el que un derivado de cumarina (donante) y un resto de fluoresceína (aceptor) están unidas por un núcleo de cefalosporina. A la entrada pasiva en la célula eucariota, la no fluorescente esterificado compuesto CCF4 / AM es procesada por esterasas celulares a la CCF4 cargado y fluorescente y por lo tanto atrapadodentro de la célula. La excitación de la fracción de cumarina a 405 nm en los resultados de FRET a la fracción de fluoresceína, que emite una señal de fluorescencia verde a 530 nm. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina por la FRET beta-lactamasa se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul at460 nm. Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, se utilizó la técnica en un modelo de infección de ratón para identificar las poblaciones de leucocitos específicos para la translocación in vivo 17-19 de. Lectura de las señales puede llevarse a cabo utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. Es de destacar que el método también ofrece la posibilidad de controlar la translocación en tiempo real mediante microscopía de células vivas durante el proceso de infección 20,21. Aquí microscopía de fluorescencia de escaneo láser se aplicó durante readout de señales de fluorescencia, ya que proporciona mayor sensibilidad y precisión. En particular, la capacidad para ajustar la ventana de emisión con una precisión nanométrica en combinación con detectores de alta sensibilidad optimizada facilita la detección de fluorescencia y minimizar la diafonía. Además esta configuración microscopía puede ser adaptado para la monitorización en tiempo real de translocación y potencialmente permite para el análisis simultáneo de interacción huésped-patógeno a nivel celular.
En este estudio, las tasas de translocación de una Y. Se analizaron ejemplarmente enterocolitica cepa de tipo salvaje y un mutante de deleción YopE exhibiendo un fenotipo hypertranslocator 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estamos aquí, aplicado con éxito un ensayo basado TEM-1 reportero beta-lactamasa para el análisis cuantitativo de la translocación efector por Y. enterocolitica. Muchas variaciones diferentes de esta técnica sensible, específico y relativamente sencillo han sido descritos en la literatura. En este estudio de microscopía de barrido láser se llevó a cabo para la detección más sensible y precisa de las señales de fluorescencia. Específicamente, la corrección para la diafonía entre el donant…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
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