מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Summary

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Abstract

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Introduction

Viral infections are a constant threat to the public health and a significant cause of epidemic diseases, morbidity, and deaths worldwide. Specific modes of control against viral infections include vaccine development and antiviral therapies. While vaccine efforts have proven successful in immunizing against several viruses, many viral pathogens remain without a protective vaccine including dengue virus (DENV), human cytomegalovirus (HCMV), hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), and respiratory syncytial virus (RSV)^1-5. Antivirals, on the other hand, play an important role for the management of these viral infections when prophylactic vaccines are unavailable. However, to date, only few licensed and cost-effective antiviral drugs are available compared to the number of viral pathogens that threatens the public health. More importantly, due to an increase in global travel and rapid urbanization, the situation is aggravated by risks of epidemic outbreaks from emerging/re-emerging viral infections that are being introduced into non-indigenous areas⁶. Recent outbreaks caused by severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, influenza viruses (H1N1, H5N1, H3N2, and H7N9), DENV, West Nile virus (WNV), measles virus (MV), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) virus, and Ebola virus^6-12 are among the examples reflecting the need for antivirals development when immunization and/or therapeutics are unavailable. In addition, there is always a potential risk of generating drug-resistant infections with currently used antivirals. Thus, the continuous development and expansion of the scope of antivirals to these emerging/re-emerging viral infections are necessary to provide better management strategies and safeguard the public health.

Most antiviral therapies consist of direct acting antivirals (DAAs) which target a specific viral protein or cofactor that mediates important steps in the viral life cycle. For example, the nucleoside analogue Acyclovir inhibits herpesvirus DNA polymerase, protease inhibitors Boceprevir and Telaprevir antagonize the HCV NS3, and Oseltamivir and Zanamivir are neuraminidase inhibitors that block the release of influenza virus particles from infected cells^13-15. There are however very few licensed viral entry inhibitors including Enfuvirtide, which targets HIV gp41 to prevent fusion, and Maraviroc, which blocks the HIV co-receptor CCR5, thereby preventing viral entry¹⁶. Exploring novel antagonists/inhibitors to viral entry could help provide additional therapeutics for prophylactic or therapeutic use, such as in combination with other antivirals with a different mechanism of action to better manage viral infections^17-19.

Identification of antivirals can involve structure-guided drug design and candidate drug screening-based strategy. Methods for assessing antiviral activity of test agents include biochemical assays of enzymatic activity and evaluation by cell-based systems^20-23. In cell-based systems, the viral life cycle can be dissected into distinct stages of infection, such as entry events (attachment, fusion, uncoating), the replication phase (viral genome replication and protein translation), and virion egress (assembly, maturation, and release). Since the assays can be adapted to investigate each specific stage using various tools and methods, this approach allows identification/examination of potential candidate antivirals with a specific mechanism of action targeting the distinct stage analyzed. For instance, to analyze drug effect specifically on the free virus particles prior to binding to the host cell, a ‘viral inactivation assay’ can be performed. In this assay, the virus is allowed to incubate with the test drug and then diluted to titrate out the drug before infecting a cell monolayer. Additional steps such as viral attachment and entry/fusion stages can also be analyzed individually, by shifting the temperature during the infection. For many enveloped viruses, viral entry/fusion at the host cell membrane is greatly facilitated at 37 °C, but is typically precluded at 4 °C which does not affect virus binding^24-29. Finally, the use of reporter viruses or cell systems could facilitate these studies and permit a high-throughput analysis.

We previously employed the cell-based approach and dissected the early entry of various enveloped viruses for the examination of antiviral compounds that potentially antagonize viral entry^30,31. Herein, the various methods used, including viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion assays, are described.

Protocol

הערה: ודא שכל ההליכים כרוכים בתרבית תאים וזיהום בנגיף מתנהלים בברדסי בטיחות ביולוגית מוסמכים המתאימים לרמת הבטיחות הביולוגית של הדגימות בטיפול. לצורך המתאר את הפרוטוקולים, HCV-מתויג כתב בלוציפראז Gaussia משמש כוירוס מודל 32. בהקשר של תוצאות הנציג, חומצת chebulagic תרכובות (CHLA) וpunicalagin (PUG) משמשים כאנטי-נגיפיים מועמד כי יעד אינטראקציות גליקופרוטאין נגיפיים עם glycosaminoglycans פני תא בכניסת ויראלי מוקדם שלבים 31. הפרין, אשר ידוע להפריע לכניסה של וירוסים רבים 30,31,33,34, משמש כטיפול שליטה חיובי בהקשר כזה. לרקע בסיסי על טכניקות וירולוגיה, התפשטות של וירוסים, קביעת כייל נגיף, וביטוי של מינון זיהומיות ביחידות פלאק ויוצרים (PFU), להתמקד יחידות יוצרים (FFU), או ריבוי של זיהום (משרד הפנים), הקורא הוא מחדשהופנה להתייחסות 35. לדוגמאות קודמות ותנאים מותאמים המשמשים לאיתור וירוסים המוצגים בתוצאות הנציג, הקורא נקרא אזכור 30-32,36-39 כמו גם פרטים המופיעים בטבלה 1, איור 1 א, ואיור 2 א. תרבות 1. תא, הכנת מתחם, וCytotoxicity מתחם לגדול קו התא המתאים למערכת הזיהום בנגיף להיות מנותח (טבלה 1). לHCV, לגדול הא-7.5 תאים בינוניים השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), 200 U / פניצילין G מיליליטר, 200 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B. הכן את תרכובות בדיקה ובקרת שימוש בממסים שלהם: למשל, לפזר CHLA ופג בsulfoxide דימתיל (DMSO); להכין הפרין במים מזוקקים כפולים סטרילי. לכל דילולים הבאים, להשתמש בתקשורת ובתרבות. הערה: concent הסופימנה של DMSO בטיפולי מתחם מבחן היא פחות מ -1% בניסויים; DMSO 1% כלולים כטיפול ביקורת שלילי במבחנים להשוואה. לקבוע הרעיל של תרכובות הבדיקה (למשל, CHLA וPUG) בתאים לזיהום ויראלי באמצעות קביעת כדאיות תא מגיב כמו XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-ניטרו-5-sulfophenyl] -5-Phenylamino) -carbonyl] -2H-tetrazolium הידרוקסיד): לHCV, זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה. החל שליטת DMSO (1%) או ריכוזים הולכים וגדל של CHLA תרכובות בדיקה וPUG (לשעבר. 0, 10, 50, 100, ו -500 מיקרומטר) לבארות התרבות בשלושה עותקים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, ואז להשליך את המדיום בצלחת ולשטוף את התאים עם 200 μl של נאגר מלוח פוספט (PBS) פעמיים. להוסיף assayin של 100 μlפתרון גרם מערכה במבחנה assay טוקסיקולוגיה מבוססת XTT לכל היטב דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 3 שעות כדי לאפשר XTT ייצור formazan. לקבוע את הספיגה עם קורא microplate באורך גל של 492 ננומטר בדיקה ואורך גל של 690 ננומטר התייחסות. לחשב את אחוז הישרדות תאים באמצעות הנוסחה הבאה: כדאיות תא (%) = ב/ כ× 100%, שבו 'ב'ו' בשם 'מתייחס לספיגה של תרכובות הבדיקה ובקרת הממס (לשעבר DMSO 1%. טיפולים), בהתאמה. קבע את הריכוז של 50% רעילים סלולארי (CC 50) של תרכובות בדיקה מתוכנה אנליטיים כגון GraphPad פריזמה על פי הפרוטוקול של היצרן. 2. Readout של זיהום ויראלי הערה: קריאת הנתונים של זיהום ויראלי תלוי במערכת הווירוס השתמשה ויכולות לערב שיטות כגון מבחני פלאק או מאה שSuring אותות כתב מוירוסים מתויג כתב. השיטה לאיתור זיהום הכתב-HCV מבוסס על פעילות הכתב בלוציפראז מתוארת להלן. לאסוף supernatants מהבארות נגועות ולהבהיר ב17,000 XG ב microcentrifuge למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. מערבבים 20 μl של supernatant מבחן 50 μl של מצע בלוציפראז מערכת assay בלוציפראז Gaussia ולמדוד ישירות עם luminometer לפי הוראות היצרן. הגעה infectivity HCV כיומן 10 יחידות יחסי אור (RLU) לקביעת עיכוב נגיפי (%) ולחשב את 50% הריכוז יעיל (EC 50) של תרכובות הבדיקה נגד זיהום HCV באמצעות אלגוריתמים מהתוכנה GraphPad פריזמה על פי הפרוטוקול של היצרן. 3. ויראלי האיון Assay הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שוניםמחדש מופיע באיור 1 א. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה. דגירה תרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) עם חלקיקי HCV על ​​37 מעלות צלזיוס (איור 1 א, 'לטווח ארוך " ) ביחס של 1: 1. לדוגמא, לבידוד נגיף 100 μl המכיל 1 x 10 4 FFU, להוסיף לדילול עובד 100 מיקרומטר CHLA 100 μl; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר. לדלל את תערובת הסמים וירוס ריכוז ל" תת-טיפולי "(יעיל) של תרכובות הבדיקה. לדוגמא, הריכוז יעיל של CHLA וPUG נגד HCV הוא במיקרומטר 1 31; לכןזה דורש דילול של פי 50 מתערובת הסמים וירוס שיכול להיות מושלמת עם 9.8 מיליליטר של המדיום בסיסי (בינוני culturing תא עם 2% FBS). הערה: הדילול לריכוז תת-טיפוליים מונע אינטראקציה משמעותית בין תרכובות הבדיקה ופני השטח של התא המארח, ומאפשר בדיקה של השפעת טיפול על virions התא ללא. שים לב שדילול זה תלוי בתגובת המינון אנטי של תרכובות המבחן נגד זיהום ויראלי מסוים, והוא נקבע לפני ביצוע assay המסוים הזה 31. לשם השוואה, לערבב את הווירוס עם תרכובות בדיקה ומייד לדלל (אין תקופת דגירה) לריכוז תת-טיפולי לפני הזיהום (איור 1 א, 'לטווח קצר "). להוסיף את התערובת של HCV-התרופה מדוללת 100 μl על הא-7.5 monolayer התא (כמות הנגיף היא עכשיו ב1 x 10 2 FFU; משרד הפנים סופיים = 0.01) ודגירה של 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר נגיפיספיחה. בעקבות הזיהום, להסיר את inocula המדולל ולשטוף בעדינות את הבארות עם 200 μl של PBS פעמיים. הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים. החל ממדיום בסיס 100 μl היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '. 4. Assay הקובץ המצורף ויראלי הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שונים המופיעות באיור 2 א, 'קובץ מצורף'. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה. טרום צמרמורת monolayers התא בצלחות ב 4 ° C FOR 1 שעה. שיתוף לטפל בתאים עם הבידוד HCV (משרד הפנים = 0.01) ותרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, לבידוד נגיף 90 μl המכיל 1 x 10 2 FFU, להוסיף 10 μl של דילול עובד 500 מיקרומטר CHLA; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר וזיהום על ידי HCV במשרד הפנים = 0.01 על monolayer התא. הערה: חשוב לבצע את הניסוי על 4 מעלות צלזיוס שכן הוא מאפשר לוירוס מחייב אך מונע כניסה אשר מתרחשת באופן יעיל ביותר על 37 מעלות צלזיוס. בצע את התוספת של תרכובות וירוס ובדיקה על קרח והדגירה שהתפתחה במקרר 4 ° C על מנת להבטיח שהטמפרטורה נשמרת על 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ולשטוף בעדינות את monolayer התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים. הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים <./ Li> החל ממדיום בסיס 100 μl היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '. 5. כניסה / Assay Fusion ויראלי הערה: דוגמא לתקופות דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שונים המפורטות ב'הכניסה / היתוך 'איור 2 א. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה. טרום צמרמורת monolayers התא בצלחות על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להדביק את התאים עם HCV (משרד הפנים = 0.01) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, השתמש הבידוד נגיף 100 μl המכיל 1 x 10 2 FFU. הערה: בצע addition של הבידוד הנגיפי על קרח והדגירה שהתפתחה במקרר 4 ° C כדי לשמור על הטמפרטורה 4 ° C, המאפשר כניסה מחייבת אך לא ויראלי. הסר את supernatant ולשטוף בעדינות monolayers התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים. הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים. פנק את הבארות עם תרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, להוסיף 10 μl של דילול עובד 500 מיקרומטר CHLA 90 μl של תקשורת, לערבב, וטיפול בבארות; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר. הערה: המעבר מ4 מעלות צלזיוס עד 37 מעלות צלזיוס עכשיו מקלה אירוע כניסה / היתוך הנגיפי ולכן מאפשרת הערכה של ההשפעה "תרכובות בדיקה בשלב מסוים זה. לשאוב supernatant המכיל סמים ולהסיר הלא הפניםוירוסים תאיים או על ידי שטיפה עם 200 μl של חיץ ציטרט (נתרן ציטרט 50 מ"מ, 4 מ"מ אשלגן כלורי, pH 3.0) או PBS. החל ממדיום הבסיס 100 μl לפני דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '.

Representative Results

באיור 1, 'assay איון ויראלי' בוצע לבחון האם שתי CHLA הספציפי טבעי התרכובות וPUG יכולים להשבית הווירוסים עטפו השונים במדינה ללא תא ולמנוע זיהום שלאחר מכן. תגובת המינון הרעילה ואנטי של תרכובות אלה נקבעה קודם לביצוע מחקר מכניסטית 31. היו מראש שטופלו הווירוסים עם תרכובות בדיקה ולאחר מכן תערובות הסמים וירוס היו בדילול לריכוזים תת-טיפוליים לפני החיסון על monolayer התא המתאים לכל מערכת וירוס. כפי שניתן לראות באיור 1, שני CHLA וPUG הופיעו לאינטראקציה עם virions ללא הסלולרי, וכתוצאה מכך השפעות בלתי הפיכות שהגנה על monolayer התא מהזיהום שלאחר מכן. שתי תרכובות המבחן השיגו עיכוב 100% ליד נגד HCMV, HCV, וDENV-2, ואילו 60 – בלוק 80% נצפה נגד MV וRSV. סג תוצאות אלוest שיש לי CHLA וPUG השפעה ישירה על חלקיקי הנגיף הללו בחינם על ידי inactivating ונטרול infectivity. באיור 2, את הקובץ המצורף וכניסה / מבחני היתוך בוצעו כדי לחקור את ההשפעה של CHLA וPUG נגד אירועים אלה מוקדם נגיפיים הקשורות לכניסה מHCMV, HCV, DENV-2, MV, וRSV. CHLA וPUG שני מנעו מחייב של הווירוסים נחקרו על התא מארח בהתאמה, כפי שמוצגים על ידי עיכוב בזיהום נגיפי וכתוצאה מכך (איור 2, 'קובץ מצורף': פסים אפורים בהירים). ההשפעה המעכבת על קובץ מצורף וירוס על ידי שני התרכובות דומה נגד HCMV (איור 2), HCV (איור 2 ג), DENV-2 (איור 2 ד), וRSV (איור 2F), הנע 90-100%. מצד השני, PUG הופיע להיות יעיל יותר מאשר CHLA נגד MV המחייב (איור 2E), עם שיעור העיכוב מTWתרכובות o משתנות בין 50 – 80%. הפרין טיפול שליטה, אשר ידוע לחסום כניסה של וירוסים רבים, גם קובץ מצורף עכבות של HCMV, DENV-2, RSV, מודעת MV, אבל היה פחות יעיל נגד HCV. "Assay כניסה / היתוך ויראלי 'שלאחר מכן בדק האם CHLA וPUG שמרו את פעילותם במהלך שלב כניסת וירוס / היתוך (איור 2,' כניסה / היתוך ': פסים אפורים כהים). שוב, שתי CHLA וPUG נצפו לפגוע ביעילות צעד כניסה / היתוך הנגיפי של הווירוסים שנבדקו (איור 2 ב – F), מניב 50 – 90% השפעה מגנה על monolayer התא המתאים. הפרין גם כניסה / היתוך בעצמת עכבות בDENV-2 וזיהומי RSV, אך היה פחות יעיל נגד HCMV, HCV, וMV (<עיכוב של 40% בממוצע). וירוס סוג התא HCMV <td> HEL HCV הא-7.5 DENV-2 Vero MV CHO-SLAM RSV הפ-2 טבלה 1:. סוג התא מארח לזיהום ויראלי סוג התא המשמש לכל מערכת זיהום ויראלי שתוארה בתוצאות הנציג מצויינים. ניתן למצוא פרטים נוספים על התאים בהתייחסות 31. איון איור 1. של זיהומים נגיפיים על ידי CHLA תרכובות בדיקה וPUG טופלו וירוסים שונים עם תרכובות הבדיקה לתקופה ארוכה. (טופחה במשך 1.5-3 שעות לפני טיטרציה; ברים אפורים בהירים) או תקופה קצרה (בדילול מייד; אפור כהה ברים) על 37 מעלות צלזיוס לפני דילול לConcentra תת-טיפוליtion וניתוח שלאחר מכן של זיהום בתאי המארח המתאים. (א) שרטוטים של הניסוי (מוצג משמאל) עם ריכוז הווירוס הסופי (PFU / טוב או משרד הפנים), לטווח ארוך תקופת דגירה סמים וירוס (i), וזמן דגירה לאחר מכן (ii) מצויינים עבור כל וירוס בטבלה בצד הימין. הניתוח לHCV HCMV (ב), (ג), (ד) DENV-2, (E) MV, וRSV (F) מצוין בכל לוח נוסף. תוצאות הם זממו נגד טיפול DMSO השלילי שליטה לזיהום בנגיף והנתונים המוצגים הם אמצעי ± שגיאות תקן של הממוצע (SEM) משלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהתייחסות 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. הערכה של פעילות אנטי של CHLA תרכובות בדיקה וPUG נגד מצורף וירוס וכניסה / היתוך. (א) ההליך ניסיוני, ריכוז וירוס (PFU / טוב או משרד הפנים), והזמן של חיבור וטיפול בתרכובות הבדיקה (I, II, III) מוצגים לכל וירוס בשרטוטים והשולחנות הקשורים. בניתוח קובץ מצורף וירוס (פסים אפורים בהירים), monolayers של סוגי תאים שונים היו מראש מקורר-על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן טופל בשיתוף עם וירוסי בהתאמה ותרכובות מבחן על 4 מעלות צלזיוס (1.5-3 שעות; i) לפני הכביסה את מחסן ותרכובות מבחן לדגירה לאחר מכן (37 ° C; ii) ובדיקה של זיהום בנגיף. בכניסת וירוס / ניתוח איחוי (פסים אפורים כהים), monolayers תא זרע היו טרום צונן על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן קרא תיגר עם וירוסי בהתאמה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5-3 שעות (i). תאים היו אזשטף וטופל בתרכובות המבחן לתקופת דגירה נוספת (ii) שבמהלכה הטמפרטורה הועברה 37 ° C כדי להקל על אירוע כניסה / היתוך ויראלי. בסוף הדגירה, וירוסים תאיים הוסרו על ידי שני חיץ ציטרט (pH 3.0) או שוטף PBS והתאים הודגרו נוספים (iii) לניתוח של זיהום בנגיף. תוצאות עבור HCV HCMV (ב), (ג), (ד) DENV-2, (E) MV, וRSV (F) מצוינות בכל לוח נוסף. הנתונים הם זממו נגד טיפול ביקורת השלילי DMSO של זיהום בנגיף ומוצגים כאמצעי ± SEM משלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהתייחסות 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

In this report the methods to identify and evaluate antiviral compounds based on a mechanistic approach of dissecting the early viral entry events were described. Specifically, the assays allowed us to examine the effect of test compounds on free virus particles, viral attachment, and viral entry/fusion. Critical steps were implemented to distinctly evaluate the drug effect on the specific stage of early viral entry. For instance, in the ‘viral inactivation assay’, the dilution of the virus-drug mixture to sub-therapeutic concentration prevents significant interaction between the test compound and the host cell surface by ‘titrating out’ the drug. This ensures that the inhibitory effect observed on the subsequent infection of the host cell is due to a direct interaction between the test compound and the cell-free virions, rather than an effect from the test compound on host cell membrane or membrane-associated molecules, including viral receptors³⁰. Similarly, the shift in temperature between 4 °C (which allows for virus binding but not entry) and 37 °C (which facilitates virus entry/fusion) in the ‘viral attachment assay’ and ‘viral entry/fusion assay’ are crucial to determine the test compound’s effect on each of these specific events. This is feasible due to the temperature sensitivity of enveloped viruses during these steps in the infection^24-29. It is therefore important that the assays are performed at the indicated temperature to ensure the accuracy of the results; for example, by carrying out the experiment on ice to maintain at 4 °C and by placing the sample directly in a 37 °C incubator for the temperature shift. In addition, the use of negative (ex. DMSO solvent for drug preparation) and positive (ex. heparin treatment) controls also help further establish the assays’ accuracy. The utility and applicability of such methods have been demonstrated in many antiviral studies^{26,30,31,40,41}. Note that while heparin is included as a control for all three assays in the context of the representative results, it typically blocks the initial virus binding rather than the ensuing fusion/entry step (as reflected by the data in Figure 2). Additional controls could also be used, such as neutralizing antibodies directed against the virus (for viral inactivation assay), antibodies that mask the cell surface receptors for the virus (for viral attachment assay), and membrane fusion inhibitors (for viral fusion/entry assay).

The assays described in this report, which are specific to the early stages of the viral infection, are useful in terms of application as secondary tests to characterize the mechanism of action of candidate drugs from primary screens which typically target the viral infection more broadly. Alternatively, they could also be incorporated in primary screens if one is specifically looking for inhibitors of early viral entry, including virus inactivating agents, viral attachment antagonists, and inhibitors to viral entry/fusion. In this case, their use allows a more focused and precise screen analysis for the identification of mechanism-specific antiviral candidates, which, in turn, would expedite downstream drug development.

The use of cell-based assays in identifying antiviral agents provides several important advantages compared to biochemical assays, including revealing potential off-target effects (such as cytotoxicity) and adding physiological relevance to the bioactivity of the test agents⁴². These issues are important considerations for deciding whether a candidate agent is of value for continuation in subsequent phases of drug development. Similarly, the early viral entry-specific assays described in this report allow examination of the drug effect on the distinct viral entry stage at the cellular level, and more specifically in the context of an authentic viral infection in vitro. The results obtained from such assays would therefore help better predict the antiviral efficacy of the test compounds and also identify potentially unwanted off-target effects against the host cell. One potential limitation though, is that an in vitro cell-based assay may not completely reflect the actual in vivo entry step in the context of a natural viral infection. Nonetheless, the assays presented in this protocol do serve as an analytical platform for mechanism-based identification and evaluation of novel antiviral agents.

The development of reporter viruses or reporter cell systems to quantitate the amount of viral infection has greatly facilitated cell-based screening and evaluation of antiviral compounds. Examples include the use of recombinant viruses carrying a reporter gene or by means of recombinant human cell lines containing a reporter gene driven by the specific virus promoter^31,43. In this report, the infection from luciferase-tagged HCV can be easily monitored by quantitating the reporter signal, thus facilitating data analysis. By incorporating these useful reporter-based tools, the early viral entry assays described here can essentially be adapted into high-throughput format for mechanism-based screening of small molecule libraries.

In conclusion, a protocol was described for assays dissecting the early viral entry as a means of identifying and evaluating mechanism-specific antiviral compounds. Such assays would be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to viral entry and help expand the scope of antiviral agents for development as prophylactic and/or therapeutic treatments.

Materials

DMEM	GIBCO	11995-040
FBS	GIBCO	26140-079
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
DMSO	Sigma	D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Microplate reader	Bio-Tek Instrument, Inc.	ELx800
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit	New England Biolabs	E3300L
Luminometer	Promega	GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate	Sigma	71402
Potassium chloride	Sigma	P5405