Tidlig Viral Entry Analyser for identifisering og evaluering av Antiviral Forbindelser

Summary

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Abstract

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Introduction

Viral infections are a constant threat to the public health and a significant cause of epidemic diseases, morbidity, and deaths worldwide. Specific modes of control against viral infections include vaccine development and antiviral therapies. While vaccine efforts have proven successful in immunizing against several viruses, many viral pathogens remain without a protective vaccine including dengue virus (DENV), human cytomegalovirus (HCMV), hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), and respiratory syncytial virus (RSV)^1-5. Antivirals, on the other hand, play an important role for the management of these viral infections when prophylactic vaccines are unavailable. However, to date, only few licensed and cost-effective antiviral drugs are available compared to the number of viral pathogens that threatens the public health. More importantly, due to an increase in global travel and rapid urbanization, the situation is aggravated by risks of epidemic outbreaks from emerging/re-emerging viral infections that are being introduced into non-indigenous areas⁶. Recent outbreaks caused by severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, influenza viruses (H1N1, H5N1, H3N2, and H7N9), DENV, West Nile virus (WNV), measles virus (MV), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) virus, and Ebola virus^6-12 are among the examples reflecting the need for antivirals development when immunization and/or therapeutics are unavailable. In addition, there is always a potential risk of generating drug-resistant infections with currently used antivirals. Thus, the continuous development and expansion of the scope of antivirals to these emerging/re-emerging viral infections are necessary to provide better management strategies and safeguard the public health.

Most antiviral therapies consist of direct acting antivirals (DAAs) which target a specific viral protein or cofactor that mediates important steps in the viral life cycle. For example, the nucleoside analogue Acyclovir inhibits herpesvirus DNA polymerase, protease inhibitors Boceprevir and Telaprevir antagonize the HCV NS3, and Oseltamivir and Zanamivir are neuraminidase inhibitors that block the release of influenza virus particles from infected cells^13-15. There are however very few licensed viral entry inhibitors including Enfuvirtide, which targets HIV gp41 to prevent fusion, and Maraviroc, which blocks the HIV co-receptor CCR5, thereby preventing viral entry¹⁶. Exploring novel antagonists/inhibitors to viral entry could help provide additional therapeutics for prophylactic or therapeutic use, such as in combination with other antivirals with a different mechanism of action to better manage viral infections^17-19.

Identification of antivirals can involve structure-guided drug design and candidate drug screening-based strategy. Methods for assessing antiviral activity of test agents include biochemical assays of enzymatic activity and evaluation by cell-based systems^20-23. In cell-based systems, the viral life cycle can be dissected into distinct stages of infection, such as entry events (attachment, fusion, uncoating), the replication phase (viral genome replication and protein translation), and virion egress (assembly, maturation, and release). Since the assays can be adapted to investigate each specific stage using various tools and methods, this approach allows identification/examination of potential candidate antivirals with a specific mechanism of action targeting the distinct stage analyzed. For instance, to analyze drug effect specifically on the free virus particles prior to binding to the host cell, a ‘viral inactivation assay’ can be performed. In this assay, the virus is allowed to incubate with the test drug and then diluted to titrate out the drug before infecting a cell monolayer. Additional steps such as viral attachment and entry/fusion stages can also be analyzed individually, by shifting the temperature during the infection. For many enveloped viruses, viral entry/fusion at the host cell membrane is greatly facilitated at 37 °C, but is typically precluded at 4 °C which does not affect virus binding^24-29. Finally, the use of reporter viruses or cell systems could facilitate these studies and permit a high-throughput analysis.

We previously employed the cell-based approach and dissected the early entry of various enveloped viruses for the examination of antiviral compounds that potentially antagonize viral entry^30,31. Herein, the various methods used, including viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion assays, are described.

Protocol

Merk: Sørg for at alle prosedyrer som involverer cellekultur og virusinfeksjon gjennomføres i sertifiserte biosikkerhet hetter som er aktuelle for biosikkerhet nivå av prøvene som håndteres. For det formål å beskrive protokollene, er Gaussia luciferase reporter-merket HCV brukt som modell virus 32. I sammenheng med de representative resultater, er det forbindelser chebulagic syre (chlA) og punicalagin (PUG) brukes som kandidat antivirale som retter seg mot virus glykoprotein interaksjoner med celleoverflate glykosaminoglykaner i løpet av tidlig viral oppføring trinn 31. Heparin, som er kjent for å interferere med oppføring av mange virus 30,31,33,34, blir brukt som en positiv kontroll behandling i en slik sammenheng. For grunnleggende på bakgrunn virologi teknikker, formering av virus, bestemmelse av virus titer, og ekspresjon av smittsom dose i plakkdannende enheter (PFU), fokuserer dannende enheter (FFU), eller infeksjonsmultiplisitet (MOI), er leseren retrukket å referere 35. For tidligere eksempler og de ​​optimale betingelser anvendt for virus som er vist i de representative resultater, henvises leseren til referanser 30-32,36-39 samt detaljer er angitt i tabell 1, figur 1A, og figur 2A. 1. Cell Culture, Compound Forberedelse og forbindelse Cytotoksisitet Vokser den respektive cellelinje for virusinfeksjon systemet som skal bli analysert (tabell 1). For HCV, dyrke Huh-7.5-celler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 200 U / ml penicillin G, 200 ug / ml streptomycin, og 0,5 pg / ml amfotericin B. Fremstille testforbindelsene og kontrollene ved hjelp av deres respektive oppløsningsmidler, for eksempel, oppløses chlA og PUG i dimetylsulfoksid (DMSO); fremstille heparin i sterilt dobbelt-destillert vann. For alle etterfølgende fortynninger, bruke kulturmedier. Merk: Den endelige concentrasjon av DMSO i testforbindelsen behandlinger er mindre enn 1% i forsøkene; 1% DMSO er inkludert som en negativ kontroll behandling i assayene for sammenligning. Bestemme cytotoksisiteten av testforbindelsene (f.eks chlA og Mops) på cellene for viral infeksjon ved å benytte et celle-levedyktighet bestemme reagens slik som XTT (2,3-bis [2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl] -5-fenylamino) karbonyl] -2H-tetrazolium-hydroksid): For HCV, frø Huh-7,5-celler i en 96-brønns plate (1 x 10 4 celler per brønn) og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N for å oppnå et monolag. Anvende DMSO-kontroll (1%) eller økende konsentrasjoner av testforbindelsene chlA og PUG (f.eks. 0, 10, 50, 100 og 500 uM) til kulturbrønnene i tre eksemplarer. Inkuber ved 37 ° C i 72 timer, og deretter kaste mediet i platen og vaske cellene med 200 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) to ganger. Tilsett 100 ul assaying oppløsning fra XTT-basert in vitro toksikologi analysesett til hver brønn og inkuber platene ved 37 ° C i ytterligere 3 timer for å tillate XTT formazan produksjon. Bestem absorbansen med en mikroplateleser ved en testbølgelengde på 492 nm og en referansebølgelengde på 690 nm. Beregn prosentandelen av overlevende celler ved hjelp av følgende formel: cellenes levedyktighet (%) = I / As x 100%, hvor "I" og "As" refererer til absorbans av testforbindelsene, og løsningsmidlet kontroll (for eksempel 1% DMSO. behandlinger), henholdsvis. Bestemme konsentrasjonen av 50% cellulær cytotoksisitet (CC 50) av testforbindelsene fra en analyseprogramvare som GraphPad Prism i henhold til produsentens protokoll. 2. Avlesning av virusinfeksjon Merk: utlesning av viral infeksjon, avhenger av virus system som brukes, og kan involvere metoder som plakk-analyser eller measuring reporter signaler fra reporter-merket virus. Metoden for påvisning av reporter-HCV-infeksjon, basert på luciferase-rapportøraktivitet, er beskrevet nedenfor. Samle supernatanter fra de infiserte brønner og klar ved 17 000 x g i en mikrosentrifuge i 5 min ved 4 ° C. Bland 20 ul av test supernatant til 50 pl av luciferase substrat fra Gaussia luciferase assay kit og direkte måler med et luminometer i henhold til produsentens instruksjoner. Uttrykk HCV infectivity som log 10 av relative lysenheter (RLU) for bestemmelse av viral inhibering (%) og beregne den 50% effektive konsentrasjon (EC50) av testforbindelsene mot HCV-infeksjon ved bruk av algoritmer av GraphPad Prism programvare i henhold til produsentens protokoll. 3. Viral Inaktive Assay Merk: Eksempler på inkubasjonstid og viral dose for ulike virus enre oppført i figur 1A. Høyere konsentrasjoner av virus kan også testes ved å øke MOI / PFU. Seed Huh-7,5-celler i en 96-brønns plate (1 x 10 4 celler pr brønn) og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N for å oppnå et monolag. Inkuber testforbindelsene eller kontroller (sluttkonsentrasjoner er: chlA = 50 M; PUG = 50 M; heparin = 1000 pg / ml; DMSO = 1%) med HCV partikler ved 37 ° C (figur 1A, "Long-Term ' ) i et 1: 1 forhold. For eksempel vil en 100 mL virus inokulum inneholdende 1 x 10 4 FFU, tilsett 100 ul av en 100 uM chlA arbeider fortynning; Dette gir chlA behandling ved en sluttkonsentrasjon på 50 uM. Fortynn virus-legemiddelblanding til "sub-terapeutisk» (ineffektiv) konsentrasjon av testforbindelsene. For eksempel er den ineffektive konsentrasjon av chlA og PUG mot HCV på en iM 31; derforDette krever en 50-gangers fortynning av virus-legemiddelblanding som kan oppnås med 9,8 ml av basalmediet (celledyrking medium med 2% FBS). Merk: fortynning til sub-terapeutisk konsentrasjon forhindrer signifikant interaksjon mellom testforbindelsene og vertscelleoverflaten og tillater undersøkelse av behandlingseffekt på cellefrie viruspartikler. Legg merke til at denne fortynningen er avhengig av den antivirale dose-respons av testforbindelsene mot den spesielle virale infeksjon, og bestemmes før gjennomføring av denne analyse 31. Til sammenligning blandes viruset med testforbindelsene og umiddelbart fortynnet (ingen inkubasjonstid) å sub-terapeutisk konsentrasjon før infeksjon (figur 1A, "Short-Term '). Tilsett 100 ul av den fortynnede HCV-legemiddelblanding på Huh-7,5 cellemonolaget (mengden av virus er nå på 1 x 10 2 FFU, slutt MOI = 0,01) og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C for å tillate viraladsorpsjon. Etter infeksjon, fjerne den fortynnede inokulater og forsiktig vaske brønnene med 200 ul PBS to ganger. Merk: Utfør vasker forsiktig for å unngå å løfte cellene. Anvende 100 pl basalmedium til hver brønn og inkuberes ved 37 ° C i 72 timer. Analyser resulterende infeksjon av analysering av supernatanten for luciferase-aktivitet som beskrevet i '2. Avlesning av virusinfeksjon '. 4. Viral Vedlegg analysen Merk: Eksempler på inkubasjonstid og viral dose for forskjellige virus er angitt i figur 2A, 'Vedlegg'. Høyere konsentrasjoner av virus kan også testes ved å øke MOI / PFU. Seed Huh-7,5-celler i en 96-brønns plate (1 x 10 4 celler pr brønn) og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N for å oppnå et monolag. Pre-slappe av cellemonolagene i platene ved 4 ° C for 1 time. Co-behandle cellene med HCV podestoff (MOI = 0,01) og testforbindelser eller kontrollene (sluttkonsentrasjoner er: chlA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparin = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) ved 4 ° C i 3 timer. For eksempel vil en 90 pl virus inokulum inneholdende 1 x 10 2 FFU, tilsett 10 ul av en 500 uM chlA arbeider fortynning; Dette gir chlA behandling ved en endelig konsentrasjon på 50 uM og en infeksjon ved HCV ved MOI = 0,01 på cellemonolaget. Merk: Det er viktig å utføre forsøket ved 4 ° C, siden det gjør det mulig for virusbinding, men utelukker oppføring som mest effektivt opptrer ved 37 ° C. Utføre tilsetningen av viruset og testforbindelser på is og den påfølgende inkubasjon i et 4 ° C kjøleskap for å sikre at temperaturen blir opprettholdt ved 4 ° C. Fjern supernatanten og forsiktig vaske cellemonolaget med 200 ul iskald PBS to ganger. Merk: Utfør vasker forsiktig for å unngå å løfte cellene <./ li> Anvende 100 pl basalmedium til hver brønn og inkuberes ved 37 ° C i 72 timer. Analyser resulterende infeksjon av analysering av supernatanten for luciferase-aktivitet som beskrevet i '2. Avlesning av virusinfeksjon '. 5. Viral Entry / Fusion-analyse Merk: Eksempel på inkubasjonsperioder og viral dose for ulike virus er oppført i figur 2A 'Entry / Fusion ". Høyere konsentrasjoner av virus kan også testes ved å øke MOI / PFU. Seed Huh-7,5-celler i en 96-brønns plate (1 x 10 4 celler pr brønn) og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N for å oppnå et monolag. Pre-slappe av cellemonolagene i platene ved 4 ° C i 1 time. Infisere cellene med HCV (MOI = 0,01) ved 4 ° C i 3 timer. Bruk for eksempel en 100 mL virusinokulum inneholder 1 x 10 2 FFU. Merk: Utfør Addisjon av viruspodestoff på is, og den påfølgende inkubasjon i et 4 ° C kjøleskap til å holde temperaturen ved 4 ° C, som tillater viral binding, men ikke oppføring. Fjern supernatanten og forsiktig vask av cellemonolagene med 200 ul iskald PBS to ganger. Merk: Utfør vasker forsiktig for å unngå å løfte cellene. Behandle brønnene med testforbindelsene eller kontroller (sluttkonsentrasjoner er: chlA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparin = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) og inkuberes ved 37 ° C i 3 timer. For eksempel legge til 10 ul av en 500 mikrometer chlA arbeider fortynning til 90 mL av media, mikse og behandle brønner; Dette gir chlA behandling ved en sluttkonsentrasjon på 50 uM. Merk: Overgangen fra 4 ° C til 37 ° C muliggjør nå viral inngang / fusjon arrangement, og derfor tillater evaluering av testforbindelser 'virkning på dette spesielle trinn. Aspirer medikamentholdige supernatant og fjerne ikke-internalisertekstracellulære virus enten ved vasking med 200 ul sitratbuffer (50 mM natriumsitrat, 4 mM kaliumklorid, pH 3,0) eller PBS. Anvende 100 pl basalmedium før inkubering ved 37 ° C i 72 timer. Analyser resulterende infeksjon av analysering av supernatanten for luciferase-aktivitet som beskrevet i '2. Avlesning av virusinfeksjon '.

Representative Results

I figur 1, er den "virusinaktive assay" utført for å undersøke om to bestemte naturlige forbindelser chlA og PUG kunne inaktivere de forskjellige innkapslede virus i celle-fri tilstand og hindre etterfølgende infeksjon. Den cytotoksisitet og antiviral dose respons av disse forbindelsene har blitt bestemt før gjennomføring av den mekanistisk studie 31. Virusene ble forbehandlet med testforbindelsene og deretter virus-medikament-blandinger ble fortynnet til sub-terapeutiske konsentrasjoner før inokulering på den respektive cellemonolaget for hvert virus system. Som vist i figur 1, både chlA og PUG ut til å interagere med cellefrie viruspartikler, noe som resulterer i irreversible virkninger som beskyttet cellemonolaget fra den etterfølgende infeksjon. De to testforbindelser oppnås en nær 100% inhibering mot HCMV, HCV, og DENV-2, mens en 60 – 80% blokk ble observert mot MV og RSV. Disse resultatene Suggest at chlA og PUG har direkte innvirkning på disse gratis viruspartikler ved å inaktivere dem og nøytralisere deres smittsomhet. I figur 2, ble vedlegget og oppføring / fusion analyser utført for å utforske effekten av chlA og PUG mot disse tidlige virusetableringsrelaterte hendelser fra HCMV, HCV, DENV-2, MV, og RSV. Både chlA og PUG effektivt forhindret binding av de undersøkte virus ut mot den respektive vertscellen som vist ved inhibering av det resulterende viral infeksjon (figur 2, 'Vedlegg': lys grå søyler). Den inhiberende virkning på virus festing av begge forbindelser var lik mot HCMV (figur 2B), HCV (figur 2C), DENV-2 (figur 2D), og RSV (figur 2F), som strekker seg fra 90 – 100%. På den annen side, PUG syntes å være mer effektive enn chlA mot MV binding (figur 2E), med inhibering hastighet fra two Forbindelsene som varierer mellom 50 – 80%. Kontrollen behandling heparin, som er kjent for å blokkere inntrengning av mange virus, også hemmet binding av HCMV, DENV-2, RSV, ad MV, men var mindre effektiv mot HCV. Den påfølgende 'viral entry / fusion-analyse' undersøkt om chlA og PUG beholdt sin aktivitet i løpet av virus entry / fusion fase (figur 2, 'Entry / Fusion': mørkegrå søylene). Igjen ble både chlA og PUG observert for effektivt å forringe viral inngang / fusjon trinn av virusene som ble undersøkt (Figur 2B – F), hvilket gir en 50 – 90% beskyttende virkning på den respektive celle monolag. Heparin også potent hemmet entry / fusion i DENV-2 og RSV-infeksjoner, men var mindre effektiv mot HCMV, HCV, og MV (<40% hemming i gjennomsnitt). Virus Celletype HCMV <td> HEL HCV Huh-7.5 DENV-2 Vero MV CHO-SLAM RSV HEp-2 Tabell 1:. Vert-celle-type viral infeksjon celletype som brukes for hver virusinfeksjon system som er beskrevet i de representative resultater er indikert. Ytterligere detaljer angående celler kan finnes i referanse 31. Figur 1. Inaktivering av virale infeksjoner ved testforbindelsene chlA og PUG Forskjellige virus ble behandlet med prøveforbindelsene for en lang periode. (Inkubert i 1,5 – 3 timer før titrering, lys grå søyler) eller kort periode (umiddelbart fortynnet; mørkegrå bar) ved 37 ° C før fortynning til en sub-terapeutisk-konsentrasjonersjon og påfølgende analyse av infeksjon på de respektive vertsceller. (A) Skjematisk av eksperimentet (vist til venstre) med den endelige viruskonsentrasjon (PFU / brønn eller MOI), langvarig virus-medikament inkubasjonsperioden (i), og påfølgende inkubasjonstid (ii) indisert for hvert virus i tabellen til høyre. Analyse for (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, og (F) RSV er angitt i hvert ekstra panel. Resultatene er plottet mot DMSO negative kontrollbehandling for virusinfeksjon og dataene som er vist er gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien (SEM) fra tre uavhengige eksperimenter. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2. Evaluering av antivirale aktiviteter av testforbindelsene chlA og PUG mot virus feste og inngang / fusjon. (A) Den eksperimentelle prosedyre, virus konsentrasjon (PFU / brønn eller MOI), og de ​​tilsettes og behandling med testforbindelsene (i, ii, iii) blir presentert for hvert virus i tegningene og de tilhørende tabeller. I virus feste analyse (lys grå søyler), monolag av forskjellige celletyper ble pre-avkjølt ved 4 ° C i 1 time, deretter ko-behandlet med de respektive virus og testforbindelser ved 4 ° C (1,5 – 3 t; i) før vasking av immune og testforbindelsene for påfølgende inkubasjon (37 ° C, ii) og undersøkelse av virusinfeksjon. I virus inngang / fusjon analyse (mørk grå søyler), seeded cellemonolagene ble på forhånd avkjølt ved 4 ° C i 1 time og deretter utfordret med de respektive virus ved 4 ° C i 1,5 – 3 timer (i). Cellene ble derettervasket og behandlet med testforbindelsene for en ytterligere inkubasjonsperiode (ii) hvorunder temperaturen ble skiftet til 37 ° C for å lette viral inngang / fusjon event. Ved slutten av inkubasjonen ble ekstracellulære virus fjernes av en citratbuffer (pH 3,0) eller PBS-vaskinger, og cellene ble ytterligere inkubert (iii) for analyse av virus-infeksjon. Resultater for (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, og (F) RSV er angitt i hvert ekstra panel. Data er plottet mot DMSO negativ kontroll behandling av virusinfeksjon og er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse 31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

In this report the methods to identify and evaluate antiviral compounds based on a mechanistic approach of dissecting the early viral entry events were described. Specifically, the assays allowed us to examine the effect of test compounds on free virus particles, viral attachment, and viral entry/fusion. Critical steps were implemented to distinctly evaluate the drug effect on the specific stage of early viral entry. For instance, in the ‘viral inactivation assay’, the dilution of the virus-drug mixture to sub-therapeutic concentration prevents significant interaction between the test compound and the host cell surface by ‘titrating out’ the drug. This ensures that the inhibitory effect observed on the subsequent infection of the host cell is due to a direct interaction between the test compound and the cell-free virions, rather than an effect from the test compound on host cell membrane or membrane-associated molecules, including viral receptors³⁰. Similarly, the shift in temperature between 4 °C (which allows for virus binding but not entry) and 37 °C (which facilitates virus entry/fusion) in the ‘viral attachment assay’ and ‘viral entry/fusion assay’ are crucial to determine the test compound’s effect on each of these specific events. This is feasible due to the temperature sensitivity of enveloped viruses during these steps in the infection^24-29. It is therefore important that the assays are performed at the indicated temperature to ensure the accuracy of the results; for example, by carrying out the experiment on ice to maintain at 4 °C and by placing the sample directly in a 37 °C incubator for the temperature shift. In addition, the use of negative (ex. DMSO solvent for drug preparation) and positive (ex. heparin treatment) controls also help further establish the assays’ accuracy. The utility and applicability of such methods have been demonstrated in many antiviral studies^{26,30,31,40,41}. Note that while heparin is included as a control for all three assays in the context of the representative results, it typically blocks the initial virus binding rather than the ensuing fusion/entry step (as reflected by the data in Figure 2). Additional controls could also be used, such as neutralizing antibodies directed against the virus (for viral inactivation assay), antibodies that mask the cell surface receptors for the virus (for viral attachment assay), and membrane fusion inhibitors (for viral fusion/entry assay).

The assays described in this report, which are specific to the early stages of the viral infection, are useful in terms of application as secondary tests to characterize the mechanism of action of candidate drugs from primary screens which typically target the viral infection more broadly. Alternatively, they could also be incorporated in primary screens if one is specifically looking for inhibitors of early viral entry, including virus inactivating agents, viral attachment antagonists, and inhibitors to viral entry/fusion. In this case, their use allows a more focused and precise screen analysis for the identification of mechanism-specific antiviral candidates, which, in turn, would expedite downstream drug development.

The use of cell-based assays in identifying antiviral agents provides several important advantages compared to biochemical assays, including revealing potential off-target effects (such as cytotoxicity) and adding physiological relevance to the bioactivity of the test agents⁴². These issues are important considerations for deciding whether a candidate agent is of value for continuation in subsequent phases of drug development. Similarly, the early viral entry-specific assays described in this report allow examination of the drug effect on the distinct viral entry stage at the cellular level, and more specifically in the context of an authentic viral infection in vitro. The results obtained from such assays would therefore help better predict the antiviral efficacy of the test compounds and also identify potentially unwanted off-target effects against the host cell. One potential limitation though, is that an in vitro cell-based assay may not completely reflect the actual in vivo entry step in the context of a natural viral infection. Nonetheless, the assays presented in this protocol do serve as an analytical platform for mechanism-based identification and evaluation of novel antiviral agents.

The development of reporter viruses or reporter cell systems to quantitate the amount of viral infection has greatly facilitated cell-based screening and evaluation of antiviral compounds. Examples include the use of recombinant viruses carrying a reporter gene or by means of recombinant human cell lines containing a reporter gene driven by the specific virus promoter^31,43. In this report, the infection from luciferase-tagged HCV can be easily monitored by quantitating the reporter signal, thus facilitating data analysis. By incorporating these useful reporter-based tools, the early viral entry assays described here can essentially be adapted into high-throughput format for mechanism-based screening of small molecule libraries.

In conclusion, a protocol was described for assays dissecting the early viral entry as a means of identifying and evaluating mechanism-specific antiviral compounds. Such assays would be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to viral entry and help expand the scope of antiviral agents for development as prophylactic and/or therapeutic treatments.

Materials

DMEM	GIBCO	11995-040
FBS	GIBCO	26140-079
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
DMSO	Sigma	D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Microplate reader	Bio-Tek Instrument, Inc.	ELx800
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit	New England Biolabs	E3300L
Luminometer	Promega	GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate	Sigma	71402
Potassium chloride	Sigma	P5405