Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in<em> Drosophila</em

Summary

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Abstract

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introduction

Het doel van deze procedure is om verrijkte mitochondriale fracties die voldoende mitochondriale metabolieten opleveren voor metabolomics studies met behulp van Drosophila melanogaster ontwikkelen. In onze ervaring, metabolomics analyse met behulp van hele cellulaire extractie methoden zijn niet in staat om subtiele mitochondriale metaboliet veranderingen de Drosophila detecteren. Echter, mitochondriale fractionering vóór metabolomics analyse verhoogt de gevoeligheid voor mitochondriale metaboliet verschuivingen identificeren.

Mitochondriën zijn cellulaire organellen verantwoordelijk voor 90% van de energie die de cellen nodig voor normale functie ^1. De laatste jaren is erkend dat mitochondriën een veel dynamischer rol in cellulaire en organismale functie van alleen de productie van adenosine trifosfaat (ATP), en worden nu erkend als knooppunten voor de regulering van metabole homeostase ^2,3. Mitochondriën zijn het resultaat van een proces waarin endosymbiotic distinct microbiële lijnen samengevoegd ~ 1,5 miljard jaar geleden ^4. Zoals mitochondriën uitgegroeid tot ware organellen, werden genen van de endosymbiont opgenomen in de opkomende nucleaire genoom. Bij dieren vandaag ongeveer 1500 mitochondriale eiwitten nucleair gecodeerd terwijl 37 genen blijven de mtDNA, 13 die coderen voor mitochondriale eiwitten die subeenheden van het enzym complexen van oxidatieve fosforylering ^5. Coördinatie tussen mitochondria en nucleaire compartimenten nodig om een ​​goede mitochondriale functie te behouden.

Volgens de hieronder beschreven werkwijzen konden we mitochondriale metabole veranderingen de Drosophila als gevolg van manipulatie van de coördinatie van mitochondriale en nucleaire genoom te detecteren. Gebruikten we een stam van Drosophila waarin mtDNA van haar zus soorten D. simulans werd op een enkele D. geplaatst melanogaster nucleaire achtergrond ^6. Deze 'verstoord' mitonucleargenotype vergeleken met de "natieve" of co-geëvolueerde mitonuclear genotype van D. melanogaster dragen dezelfde nucleaire genoom met zijn inheemse D. melanogaster mtDNA. De D. en D. melanogaster simulans mtDNAs verschillen ~ 100 aminozuren en> 500 synoniem substituties die mitonuclear communicatie ^7,8 beïnvloeden. We gegenereerd hele fly extracten en mitochondriale verrijkte extracten metaboliet verschuivingen studeren in reactie op farmacologische stress. Hier laten we zien dat bij het ​​gebruik van mitochondriale verrijkte fracties op te sporen we duidelijke verschuivingen in het mitochondriaal metabolieten tussen de inheemse, co-geëvolueerd genotype dragen van de D. melanogaster mtDNAs en de verstoorde genotype dragen D. simulans mtDNA. In tegenstelling, de metaboliet verschillen tussen beide genotypes subtiele met normale werkwijzen die hele fly extract gebruiken. Daarom is deze werkwijze verschaft een weg te begrijpen hoe mtDNAs bemiddelen mitochondriale veranderingenreactie op verschillende drugs.

Protocol

1. Reagentia en oplossingen Voorbereiding van de vlieg voedsel en media Heat fly ingrediënten 11% suiker, 2% geautolyseerde gist, 5,2% maïsmeel, agar 0,79% w / v in water in een kookplaat ingesteld op 90 ° C. Regelmatig Roer tot een homogeen licht dichte mengsel is verkregen. Bereid een eindvolume van 550 ml vlieg voedsel voor een totaal van 100 flacons met 5 ml voedsel vliegen elk. Verwijderen uit de verwarmingsbron, roeren tot het eten afgekoeld tot 80 ° C en voeg 0,2% tegosept-methyl…

Representative Results

De protocol hierboven uitgelegd, voerden we metabolomic analyse van mitochondriale verrijkte fracties en hele dier extracten om het effect van het geneesmiddel rapamycine op uiteenlopende mtDNAs 7 testen. We geleverde 200 M van rapamycine door het oplossen van het geneesmiddel in de vlieg voedsel. Vliegen werden blootgesteld aan rapamycine gedurende 10 dagen. Metabolieten uit hele vlieg extracten en van mitochondriale extracten werden verkregen met behulp van gaschromatog…

Discussion

De meest kritische stappen in dit protocol zijn: 1) het grootbrengen genoeg vliegen in een overvloed aan ruimte. Het is zeer belangrijk om niet de demografie kooien met meer dan 150 vliegen per overpopulate; 2) het veranderen van het voedsel van de kooien vaak om voedsel concurrentie en voedingswaarde stress te vermijden; en 3) het handhaven van alle monsters bij 4 ° C om de integriteit te verzekeren tijdens de isolatie van de mitochondriale fractie. Het wordt ook aanbevolen om de isolatie buffer, het wassen buffer, en…

Materials

0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate	VWR	AAA14289
Ethanol	Sigma-Aldrich	792799
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCL	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCL	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
CO2 pads to anesthetize flies	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
1 liter cage	Web Restaurant Store	999RD32
1 liter cage lid	Web Restaurant Store	999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer	Fisher Scientific	NC9661231
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
rapamycin	LC Laboratories	R-5000
anti-porin	MitoSciences	MSA03
anti-alpha tubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	12G10
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 pad	Tritech Research, Inc	MINJ-DROS-FP
filter flask	enasco	SB08184M
rubber stopper	enasco	S08512M