대사 분석을위한 미토콘드리아 농축 분획의 제조<em> 초파리</em
Summary
Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Abstract
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
Introduction
이 절차의 목적은 초파리를 이용하여 대사 체학 연구에 대한 충분한 미토콘드리아 대사 산물을 산출 풍부한 미토콘드리아 분획을 개발하는 것입니다. 우리의 경험에 의하면, 전체 세포 추출 방법을 사용하여 대사 체학 분석은 초파리의 미묘한 미토콘드리아 대사 산물의 변화를 감지 할 수 없습니다. 그러나, 종래 대사 체학 분석 미토콘드리아 분별은 미토콘드리아 대사 변화를 식별하기 위해 감도를 증가시킨다.
미토콘드리아는 세포가 정상적인 기능 (1)에 필요한 에너지의 90 %를 제공 할 책임이 세포 소기관이다. 최근 몇 년 동안 그것은 미토콘드리아 단지 아데노신 삼인산 (ATP)를 생산하는 것보다 세포 및 유기체 기능에 훨씬 더 역동적 인 역할을하고, 지금 대사 항상성의 2,3의 규제를위한 허브로 인식되는 것을 인식하고있다. 미토콘드리아는 DIS되는 endosymbiotic 프로세스의 결과tinct 미생물 계통 1.5 억년 전에 4 ~ 합병했다. 미토콘드리아에 해당하는 세포 기관으로 발전으로, endosymbiont에서 유전자 신흥 핵 게놈에 통합되었다. 37 유전자가 산화 적 인산화 (5)의 효소 복합체의 서브 유닛이다 미토콘드리아 단백질을 인코딩 13있는 미토콘드리아 DNA에 남아있는 동안 동물 오늘날, 약 1,500 미토콘드리아 단백질은 핵 인코딩됩니다. 미토콘드리아 및 핵 구획 간의 조정은 미토콘드리아 적절한 기능을 유지하는데 필요하다.
여기에 설명 된 방법을 이용하여, 우리는 미토콘드리아 게놈과 핵 사이의 조정 조작의 결과 초파리 미토콘드리아 대사의 변화를 감지 할 수 있었다. 우리는 미토콘드리아 DNA 라 자매 종에서 초파리의 변형을 사용 simulans는 단일 D. 위에 놓는다 핵 배경 6 melanogaster의. 이 '중단'mitonuclear유전자형은 D의 '기본', 또는 공동 발전 mitonuclear 유전자형을 비교 하였다 네이티브 (D)와 같은 핵 게놈을 들고 melanogaster의 미토콘드리아 DNA를 melanogaster의. D. melanogaster의 및 D simulans mtDNAs 100 ~에 의해 아미노산과 mitonuclear 통신 7,8에 영향을 미칠> 500 동의어로 대체를 다릅니다. 우리는 약리학 적 스트레스에 반응하여 대사 산물의 변화를 연구하기 위해 전체 비행 추출물과 미토콘드리아 농축 추출물을 생성합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아 농축 분수를 사용하는 경우 우리는 (D)를 운반하는 네이티브, 공동 발전 유전자형 사이의 미토콘드리아 대사에 뚜렷한 변화를 감지 것을 보여 melanogaster의의 mtDNAs와 D를 들고 혼란 유전자형 simulans 미토콘드리아 DNA. 반면, 이들 두 유전자형 간의 대사 변화는 전체 플라이 추출물을 이용하는 통상의 방법을 사용하여 미묘. 따라서,이 방법은 mtDNAs이의 미토콘드리아 변화를 중재 방법을 이해하는 경로를 제공다른 약물에 반응.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 1) 풍부한 공간에서 충분히 파리를 양육. 그것은 150 개 이상의 파리 각각 인구 통계학 새장에 너무 많이하지 않는 매우 중요하다; 2) 자주 식품 영양 학적 스트레스 및 경쟁을 방지하기 케이지 음식을 변경하는 단계; 3) 4 ° C에서 모든 샘플을 유지하는 것은 미토콘드리아 부분의 분리시 무결성을 보장합니다. 또한 분리 완충액 세척 완충액, 및 사용 전에 유리 – ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
Materials
| 0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
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