공 촛점 분석을 사용하여<em> 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em>의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해
Summary
원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.
Abstract
이 프로토콜은 세포의 필드 분산 리간드를 시각화하는 방법을 설명한다. 함께 초기 배아에서의 세포의 큰 크기, 외래 단백질을 발현의 용이성, 제노 푸스는 GFP – 태그 리간드를 시각화하는 유용한 모델을 laevis의합니다. 합성 mRNA를 효과적으로 초기 Xenopus의 배아 내로 주입 한 후 변환되고, 주사는 단일 세포를 타겟으로 할 수있다. 이러한 막 닿는 RFP 같은 혈통 추적과 함께 사용하면 과잉 발현 된 단백질을 생산하고 주입 된 세포 (및 그 자손이) 쉽게 따라 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생산을위한 방법의 형광 주입의 mRNA에서의 Wnt 및 쉬 리간드 태그에 대해 설명합니다. 방법은 마일을 포함외배엽 외식 (동물 모자)와 여러 샘플 리간드 확산의 분석 CRO의 해부. 공 초점 영상을 사용하여, 세포의 필드 위에 리간드 분비 및 확산에 관한 정보를 얻을 수있다. 공 초점 이미지의 통계적인 분석은 리간드 구배의 형상 정량적 데이터를 제공한다. 이들 방법은 morphogen 그라디언트의 형상을 조절할 수있는 요소의 효과를 테스트 할 연구에 유용 할 수있다.
Introduction
초기 배아 발달 동안 세포가 점진적 분화의 특정 계통을 따라 약속 :이 전능성 (또는 다 능성) 하나의 세포 유형을 야기하도록 결정된 선조 세포의 개체수를 구축을 점차 제한 될 셀들의 그룹을 의미한다. 세포 – 세포 신호 배아 개발하는 동안 혈통 사양의 규제의 핵심입니다. 이러한 신호의 조작은 새로운 의학적 치료를 지원하기 위해 특정 운명 향해 줄기 세포를 지향 시키도록 요구 될 것이다.
신호 전달 경로의 상대적으로 적은 수의 TGF 상과 (nodals 및 BMPs에) 1-2 FGFs 3 Wnts 4 및 5에 대응 고슴도치 경로를 포함하여 개발하는 동안 반복된다. 이들 분비 단백질함으로써 유전자 발현 및 / 또는 세포의 행동을 변경하는 신호 전달을 활성화하는 세포막에 존재하는 수용체에 결합한다. 세포 기호의 꽉 규제Alling은 세포 혈통 사양과 정상적인 발전을 위해 필수적이다. 이들 경로들 사이의 크로스 토크는 세포의 운명을 결정하는 것도 중요하지만, 하나의 리간드는 그 자체가 다른 농도에서 별개의 응답을 이끌어 낼 수있다. Morphogen 구배는 세포 유형 세포 (6)의 필드에서 파생 할 수있는 방법 다른 설명하는 이론으로 100 년 전에 설명했다. 셀들의 하나의 그룹에 의해 생성 된 분자를 시그널링하는 것은 소스로부터 더 먼 거리와 농도의 감소, 특정 범위를 통해 확산 될 수있다. 신호에 노출 된 세포는 별개의 위치에 세포 신호의 상이한 레벨로 상이하게 응답하여, 전지의 분야에서 자신의 위치에 국소 농도에 반응 할 것이다. morphogens의 존재에 대한 증거는 초기 초파리 배아 7 및 8 날개 디스크뿐만 아니라 척추 사지 9 신경관 (10)의 연구로부터 온다.
방법은의에 필요설립 방법 morphogen 그라디언트 vestigate 이러한 구배를 조절에서 중요한 다른 분자를 식별 할 수 있습니다. 다른 유전 적 배경의 맥락에서, 생체 내에서 내인성 단백질을 가시화하기 위해 면역 조직 화학을 사용하여 우아한 실험 morphogen 구배 11-12을 조사하기 위해 사용되어왔다. 그러나, 좋은 항체 및 특정 돌연변이는 항상 사용할 수 없으며, 그래서 우리는 대안 외래 유전자 산물이 세포의 필드에 걸쳐 리간드의 분포에 영향을 미칠 수있는 방법을 절개하는 간단한 방법을 제공하는데, 제노 푸스에서 형광성 리간드의 과발현을 사용하여 여기 프로토콜을 설명한다. Xenopus의 laevis의은 초기 단계에 액세스 할 수 있도록 자신의 태아가 외부 개발로 실험 이러한 유형의를 수행 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다. 그들은 (아직도 약 20 상대적으로 큰만큼 그들의 큰 크기 (지름 1-1.5mm)는 미세 주입 및 수술 조작을 단순화하고 포배는 단계적으로 세포 이미지에 쉽게81)에 걸쳐 미터. Xenopus의에서 과발현 연구 할 간단하다 : 초기 배아에 주입 mRNA의 특정 세포를 타겟으로 할 수 있고, 효율적으로 변환됩니다.
찬란 태그 Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP는 구조가 PCS2 Wnt8a-HA (13), PCS2 Wnt11b-HA (14)와 eGFP는을 사용하여 생성되었다. HA 펩타이드는 유전자 산물 모두 작동하도록의 Wnt 및 eGFP는 단백질을 분리하는 스페이서의 역할을하는 것으로 생각되기 때문에 추가적인 분자 태그를 제공 할뿐만 아니라,하지만을 포함하는 것이 중요하다. 쉬의 시각화에 사용 구조체 이전 쉬-eGFP는 융합 단백질 (15)을 발현 트랜스 제닉 마우스를 생성하는 데 사용되었다; 이것은 친절 앤디 맥마흔에 의해 제공되었다. 중요하게는, 모든 구조에 대한 GFP 태그가 처리 후에도 유지되도록 신호 서열에 3 '복제된다. 그것은 최종 단백질 변형에 필요한 서열, 예컨대 additio 포함되어 있는지 확인하는 것도 중요같은 지질의 N은 합성의 mRNA의 prodution에 최적화되어 PCS2 + 발현 벡터에 서브 클로닝 하였다 쉬와의 Wnt ligands.The 된 cDNA의 경우입니다; 그것은 SP6 프로모터 및 폴리아 데 닐화 신호 (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors)를 포함한다.
여기에 설명 된 작업은 분비와 형광의 확산을 비교하기위한 간단한 프로토콜의 Wnt 및 쉬가 리간드 태그 태그 제공합니다. 합성의 mRNA의 정의 양을 주입하여, 프로토콜은 서로 다른 프로모터를 사용하여 다른 벡터로부터 변수 표현과 관련된 모든 문제를 주항. 이러한 방법은 최근에 쉬-eGFP는과 Wnt8a / Xenopus의 16 ~ 17에서 Wnt11b-HA-eGFP는 분비 및 확산에 헤파 란 황산 endosulfatase Sulf1의 효과를 조사하기 위해 적용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 핵심적인 부분은 일반적으로, 처리 된 분비, 및 장착 된 형광 부분이 있음에도 불구하고, 수용 세포의 반응을 유도 할 수있는 생물학적 활성 리간드를 생성한다. 이 형광 표지 된 유전자 산물은 적절한 분석법을 이용하여 생물학적으로 활성화되어 있음을 확립하는 것이 중요합니다. 쉬-GFP를 들어 PTC1의 발현을 활성화 할 수있는 능력을 확인 하였다 (16). Wnt8a는…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BBSRC에 의해 투자 된이 작품은 (BB / H010297 / 1), SAR에 BBSRC 할당량 재학 및 SWF에 MRC 학생이기을 MEP에 부여합니다.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
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