Cet article décrit le protocole détaillé et l'équipement nécessaire pour une double cartographie optique du potentiel transmembranaire (V m) et d'une connexion intra-réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ dans le coeur de lapin Langendorff perfusé. Cette méthode permet l'observation directe et la quantification de V m et SR Ca 2+ dynamique dans le coeur intact.
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Article de méthode
Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca
Dans cet article
Résumé
Résumé
La manipulation du réticulum sarcoplasmique (SR) Ca2+ joue un rôle clé dans le couplage normal excitation-contraction et la manipulation aberrante du SR Ca2+ est connue pour jouer un rôle important dans certains types d’arythmie. Parce que les arythmies sont des phénomènes émergents spatialement distincts, elles doivent être étudiées au niveau tissulaire. Cependant, les méthodes permettant de sonder directement SR Ca2+ dans le cœur intact restent limitées. Cet article décrit le protocole pour la cartographie optique double du potentiel transmembranaire (Vm) et de l’intra-SR libre [Ca2+] ([Ca2+]SR) dans le cœur de lapin perfusé par Langendorff. Cette approche tire parti de l’indicateur de faible affinité Ca2+ Fluo-5N, qui a une fluorescence minimale dans le cytosol où le [Ca2+] intracellulaire ([Ca2+]i est relativement faible) mais présente une fluorescence significative dans la lumière de la RS où [Ca2+]SR est dans la gamme millimolaire. En plus de révéler spatialement les caractéristiques de la RS Ca2+ sur toute la surface épicardique du cœur, cette approche présente l’avantage distinct de la surveillance simultanée de Vm, ce qui permet d’étudier la relation bidirectionnelle entre Vm et la RS Ca2+ et le rôle de la RS Ca2+ dans les phénomènes arythmogènes.
Introduction
La cartographie optique double du Ca2+ intracellulaire et du potentiel transmembranaire (Vm) dans le cœur intact perfusé par Langendorff est devenue un pilier des recherches en électrophysiologie cardiaque, y compris les mécanismes de l’arythmie et du couplage excitation-contraction1-4. Cette approche a fourni des connaissances sans précédent sur l’électrophysiologie normale et anormale et, surtout, sur la relation bidirectionnelle entre Vm et Ca2+ intracellulaire. Cependant, la cartographie optique du Ca2+ intracellulaire avec des indicateurs fluorescents de haute affinité (tels que Rhod-2 et Fluo-4) n....
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université de Californie, Davis, et adhéré à la Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health.
1. Préparation
- Préparer deux concentrés (25X) les stocks de solution modifiée de Tyrode à l'avance et conserver à 4 ° C: (1) Stock I (en mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) et (2) Stock II (en mM: NaHCO 3 500).
- Fraîchement préparer une solution de 2 L Tyrode....
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Résultats
La figure 1A représente un diagramme schématique de la configuration optique pour double m V SR Ca2 + et la cartographie. Avec cette configuration, il ya une séparation spectrale complète de la m V et SR Ca 2+ signaux (figure 1B). Un schéma du système de perfusion à double boucle utilisée pour Fluo-5N colorant chargement est illustrée à la figure 1C. La figure 1D montre l'orientation horizontale du coeur d.......
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Discussion
Les clés du succès Fluo-5N charge de colorant sont la configuration recirculation perfusion de petit volume, ce qui permet une concentration élevée Fluo-5N sans avoir besoin de grandes quantités de colorant, la longueur des temps de chargement (1 h), et effectuer le chargement à la température ambiante. Si le chargement est effectué à des températures physiologiques, l'activité enzymatique cellulaire rapidement clive le tag de -AM lorsque le colorant traverse la membrane cellulaire, le piégeage des molécules de colo.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par les National Institutes of Health des États-Unis (R01 HL 111600) et l’American Heart Association (12SDG9010015).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Composant de la solution de Tyrode |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Composant de la solution de Tyrode |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Composant de la solution de Tyrode |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Composant de la solution de Tyrode |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher | Scientific S369-500 | Composant de la solution |
| de Tyrode NaHCO3 | Scientific | S233-3 | Composant de la solution de Tyrode |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Composant de la solution de Tyrode |
| 95 % O2 5 % CO2 | AirCarbogen de gaz | Pour l’oxygénation et le pH de la solution de Tyrode | |
| Blebbitatine | Tocris Bioscience | 1760 | Découpleur d’excitation-contraction |
| RH237 | Biotium | 61018 | Colorant sensible au voltage |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Indicateur de faible affinité Ca2+ ; Alternative : Invitrogen F-14204 ; Le chargement doit être effectué à température ambiante |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | Pour le chargement de l’indicateur Ca2+ ; Réchauffer jusqu’à ce que la solution soit claire avant utilisation |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Pour dissoudre la blebbistatine et les colorants |
| Filtre | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μ ; m Filtre en ligne |
| Transducteur de pression | WPI | BLPR2 | Pour mesurer la pression de perfusion |
| Transpont Transducteur Amplificateur | WPI | SYS-TBM4M | Pour transduire/amplifier le signal de pression ; PowerLab peut également être utilisé avec les instruments BioAmp PowerLab |
| 26T | l’enregistrement | continu des signaux de pression et ECG | |
| THT Macroscope | SciMedia | Configuration optique macroscopique. Détails : Objectif 0,63X (NA = 0,31), objectif à condensation 2X, champ de vision résultant = 3,1 cm x 3,1 cm, profondeur de champ = ~ 1,5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Caméras de cartographie optique | |
| Spot LED de précision | Mightex | PLS-0470-030-15-S | Source lumineuse LED |
Références
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
- Lou, Q., Li, ....
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Réimpressions et autorisations
