Génération de l'intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Résumé

Ce manuscrit fournit une procédure étape par étape pour la dérivation et la maintenance des kératinocytes humains à partir de cheveux épilés et la génération ultérieure de cellules souches pluripotentes humaines induites par intégration (hiPSC) sans intégration par des vecteurs épisomiques.

Résumé

Les progrès récents en matière de reprogrammation nous permettent de transformer des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). La modélisation de la maladie à l’aide d’hiPSC spécifiques au patient permet d’étudier le mécanisme sous-jacent de la pathogenèse, fournissant également une plate-forme pour le développement du dépistage de médicaments in vitro et de la thérapie génique afin d’améliorer les options de traitement. Le potentiel prometteur des hiPSCs pour la médecine régénérative est également évident à partir du nombre croissant de publications (>7000) sur les iPSC ces dernières années. Divers types de cellules de lignées distinctes ont été utilisés avec succès pour la génération d’hiPSC, notamment les fibroblastes cutanés, les cellules hématopoïétiques et les kératinocytes épidermiques. Alors que les biopsies cutanées et les prélèvements sanguins sont couramment effectués dans de nombreux laboratoires comme source de cellules somatiques pour la génération de hiPSC, la collecte et la dérivation ultérieure des kératinocytes capillaires sont moins couramment utilisées. Les kératinocytes dérivés de cheveux représentent une approche non invasive pour obtenir des échantillons de cellules de patients. Nous décrivons ici une méthode simple et non invasive pour la dérivation de kératinocytes à partir de cheveux épilés. Nous fournissons également des instructions pour l’entretien des kératinocytes et la reprogrammation ultérieure afin de générer des hiPSC sans intégration à l’aide de vecteurs épisomaux.

Introduction

La découverte de cellules souches pluripotentes humaines induites (de hiPSCs) a révolutionné le domaine de la médecine régénérative, fournissant une méthode possible pour la production de cellules souches spécifiques à des patients ^1-3. hiPSCs ont été générés avec succès à partir de divers types de cellules somatiques, y compris des fibroblastes, des cellules hématopoïétiques ^{de 4,5 à 6,7,} les cellules epitheliales rénales à partir de l'urine et des kératinocytes ^{8 9,10.} À ce jour, les fibroblastes de la peau et des cellules hématopoïétiques représentent les sources de cellules les plus couramment utilisés pour générer des CSPi sp....

Protocole

La collection de l'échantillon de cheveux humains de personnes nécessite l'approbation éthique par le comité d'éthique de la recherche humaine dans les établissements d'accueil et doit être fait en conformité avec les directives institutionnelles.

1. Isolement de kératinocytes à partir de pileux épilé

1. Thaw matrice extracellulaire (ECM) (c.-à-Matrigel) sur la glace O / N.
2. En utilisant des pointes de pipette pré-réfrigérés, ajouter 200 solution ECM ul à 12 ml de milieu DMEM réfrigérés / F12. Manteau une plaque de 12 puits avec 1 ml de solution d'ECM dilué dans chaque puits. Incuber la plaque....

Résultats

Les cheveux passe par trois phases différentes de cycle de croissance: anagène (phase de croissance), catagène (phase de régression) et télogène (phase de repos) ^20,21. Le follicule pileux anagène contient de multiples couches de l'épithélium; ces couches comprennent les SRO, IRS et l'arbre des cheveux (Figure 1). Cheveux anagène finalement subit une transition à la phase catagène, qui est marquée par l'apoptose des SRO et la cessation de la différenciation de l'arbre de cheve.......

Discussion

Génération de hiPSCs spécifiques au patient offre une approche unique pour l'étude de la pathogenèse dans les types de cellules malades in vitro, et fournit également une plate-forme pour le criblage de médicaments pour identifier de nouvelles molécules qui peuvent sauver les phénotypes de la maladie. Cette approche de modélisation de la maladie en utilisant hiPSCs a donné des résultats prometteurs pour une variété de maladies, y compris le syndrome du QT long, la maladie de Huntington, la maladie de Parkin.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mélange d’antibiotiques :  ;
250 ng/ml Amphotéricine antimycosique B	Sigma	A2942-20ml	Le mélange d’antibiotiques est composé de PBS.
1X Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
Knockout Serum Replacement (KSR) moyen :  ;			milieu KSR est filtré à l’aide de Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) avant utilisation. Le bFGF est ajouté frais au milieu avant utilisation.
20 % de remplacement sérique knock-out (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 avec glutamax	Invitrogen	10565-042
1& fois ; Acide aminé non essentiel MEM	Invitrogen	11140-050
; 0,5&fois ; Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15140-122
; 0,1 mM de &bêta-mercaptoéthanol	Invitrogen	21985
; bFGF (10 ng/ml, ajouté frais)	Millipore	GF003
Milieu kératinocytaire :  ;
; EpiLife avec 60 et micro ; M Calcium	Invitrogen	M-EPI-500-CA
1& fois ; Supplément de croissance de kératinocytes humains (HKGS)	Invitrogen	S-001-5
Sérum de veau fœtal (FBS) milieu :  ;			Le milieu FBS est filtré à l’aide de Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) avant utilisation.
10 % de sérum fœtal bovin (FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM  ;	Invitrogen	11995-073
0,5x Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15140-122
2 mM L-glutamine	Invitrogen	25030
0,25 % trypsine-EDTA	Invitrogen	25200-056
Matrice extracellulaire (ECM) :
Matrigel	Corning  ;	354234	Aliquot Matrigel stock et stocke à -80° ; C suivant le fabricant » . La concentration de la matrice de Matrigel varie légèrement d’un lot à l’autre (~9 mg/ml). Nous recommandons d’utiliser 200µ ; l matrigel pour le revêtement d’une plaque à 12 puits (~150µ ; g/puits).  ;
Kit de matrice de revêtement  ;	Plasmides Invitrogen	R-011-K
:  ;			Notez que pCXLE-eGFP n’est utilisé que pour surveiller l’efficacité de la transfection et n’est pas nécessaire pour la reprogrammation.
-  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; pCXLE-hSK	Addgene	27078
-  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; pCXLE-hUL	Addgene	27080
transfection Fugene HD	Promega	E231B
Gélatine (à partir de peau de porc)	Sigma	G1890	Compléter 0,1 % de gélatine dans de l’eau distillée. Autoclave avant utilisation.
Milieu sérique réduit : OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
Le fibroblaste embryonnaire de souris (MEF)			être inactivé par un traitement à la mitomycine C ou une irradiation comme décrit précédemment 16.
Aiguille 26G	Terumo	NN2613R
plaque à 6 puits (culture tissulaire traitée)	BD Biosciences	353046
plaque 12 puits (culture tissulaire traitée)	BD Biosciences	353043
10 cm (culture tissulaire traitée)	BD Biosciences	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	Utilisation à 10 mg/ml
Collagénase IV	Invitrogen	17104-019	Utilisation à 1 mg/ml
Anticorps TRA-160	Millipore	MAB4360	Utilisation à 5 & micro ; g/ml
OCT4	Santa Cruz	SC-5279	Utilisation à 5 µ ; g/ml
d’anticorps NANOG	R& D Systems	AF1997	Utilisation à 10 & micro ; g/ml
MycoAlert Kit de détection	Lonza	LT07-418

Le Réactif de peut anticorps