This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.
Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.
Открытие человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) произвела революцию в области регенеративной медицины, обеспечивая приемлемый метод для генерации конкретного пациента стволовых клеток 1-3. hiPSCs успешно генерируются из различных типов соматических клеток, включая фибробласты 4,5, 6,7 кроветворных клеток, почечных эпителиальных клеток из мочи 8 и кератиноцитов 9,10. На сегодняшний день, фибробласты кожи и гемопоэтические клетки представляют собой наиболее часто используемые источники клеток для генерации конкретного пациента ИПСК. Возможно, это связано с тем, что биопсия кожи и сбор крови обычные медицинские процедуры и большие биобанки из пациентов крови или кожи образцов были созданы во многих странах.
В отличие от клеток крови и фибробластов кожи, которые требуют инвазивных методов добычи, кератиноциты представляют собой легко доступный тип клеток для генерации hiPSC. KeratinocytЭС кератин богатые эпителиальные клетки, которые образуют внешний эпидермальный барьер кожи и также найдены в ногти и волосы 11. В частности, кератиноциты можно найти на внешней оболочки корня (ПРС) волосяных фолликулов, внешний слой клеточной, которая охватывает стержень волоса вместе с внутренней оболочки корня (IRS) клеток (12, Рис 1). Как коллекция волосы простая процедура, которая не требует помощи медицинского персонала, это дает возможность для пациентов, чтобы собрать и отправить свои собственные образцы волос в лаборатории, что позволит значительно облегчить сбор образцов пациентов для поколения hiPSC. Кератиноцитов эпидермиса также имеют более высокую эффективность перепрограммирования и более быструю кинетику перепрограммирования фибробластов по сравнению с, добавив к преимуществам использования кератиноциты в качестве исходных клеток для hiPSC поколения 9,13. Кроме того, hiPSCs также могут быть получены с использованием других клеточных популяций внутри волосяного фолликула,в том числе кожных сосочков клетки, находящиеся в базе волосяного фолликула 14,15.
Предыдущие доклады поколения IPSC, с помощью волос происхождения клетки часто используют ретровирусные или лентивирусные основе методов перепрограммирования 9,14,15. Тем не менее, эти вирусные методы вносят нежелательное геномной интеграции иностранных трансгенов во перепрограммирования. Для сравнения, использование Эписомные векторов представляет собой возможно, невирусный метод перепрограммирования генерировать интеграции, свободной ИПСК 4. Ранее мы уже разработали простой, экономически эффективный и невирусный метод эффективно перепрограммировать кератиноцитов в hiPSCs использованием Эписомные векторы 13. Здесь мы предлагаем подробный протокол для генерации кератиноцитов, полученных hiPSCs, в том числе при выводе из кератиноцитов сорвал волос, расширение и техническое обслуживание кератиноцитов и последующим перепрограммированием генерировать hiPSCs.
Генерация конкретного пациента hiPSCs предлагает уникальный подход к изучению патогенеза в пораженных типов клеток в пробирке, а также предоставляет платформу для скрининга лекарственных средств для идентификации новых молекул, которые могут спасти фенотипы болезни. Это заболева?…
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.
Antibiotic Mix: | |||
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
Keratinocyte medium: | |||
EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Extracellular Matrix (ECM): | |||
Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
- pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
- pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
- pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
- pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
26G needle | Terumo | NN2613R | |
6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10mg/ml |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1mg/ml |
TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5µg/ml |
OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5µg/ml |
NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10µg/ml |
MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |