Bedömning av Perigenital känslighet och prostata Mast cellsaktivering i en musmodell av neonatal Maternal Separation

Summary

Vi mäter perigenital mekanisk känslighet och mastcellsaktivering i prostatan manliga C57BL / 6 möss som genomgick en tidig livet stressen paradigm – neonatal maternal separation, i syfte att förmå en preklinisk modell av kronisk prostatit / kronisk bäckensmärtsyndrom.

Abstract

Kronisk prostatit / kronisk bäckensmärta syndrom (CP / CPP) har en livstidsprevalens på 14% och är den vanligaste urologiska diagnos för män under 50 års ålder, men det är den minst förstådda och studerade kronisk bäckensmärta sjukdom. En betydande undergrupp av patienter med kronisk bäckensmärta rapport ha upplevt tidiga liv stress eller missbruk, som markant kan påverka funktion och reglering av hypotalamus-hypofys-binjure (HPA) axel. Mastcellaktivering, vilket har visat sig öka i både urin och uttryckta prostatasekre av CP / CPP-patienter, är delvis regleras genom nedströms aktivering av HPA-axeln. Neonatal moderns separation (NMS) har använts i över två decennier att studera resultaten av tidiga liv stress i gnagarmodeller, inklusive förändring i HPA-axeln och visceral känslighet. Här ger vi ett detaljerat protokoll för att använda NMS som en preklinisk modell av CP / CPP i manliga C57BL / 6-möss. Vi beskriver metodikenför utförande av NMS, bedöma perigenital mekanisk allodyni, och histologiska tecken på mastcellaktivering. Vi tillhandahåller också belägg för att tidigt psykisk stress kan ha långvariga effekter på den manliga urogenitala systemet hos möss.

Introduction

Kronisk bäckensmärta är inte i sig en sjukdom, utan snarare ett begrepp i samband med den pågående spontan och / eller framkallade smärta upplevs av patienter som diagnostiserats med colon irritabile (IBS), interstitiell cystit / smärtsam blåsa (IC / PBS), vulvodynia, eller kronisk prostatit / kronisk bäckensmärta syndrom (CP / CPP). Dessa syndrom är ofta samtidiga och delar många egenskaper genom att de inte har någon tillhörande patologi eller identifieras underliggande etiologi, men dysfunktion i immunsystemet, det centrala nervsystemet och perifera nervsystemet har visat sig bidra till att bevara och utvecklingen av dessa sjukdomar ^{1 -3.} Patienter med kronisk bäckensmärta är mer benägna att uppvisa symptom på ytterligare, icke-bäckenet relaterade funktionella smärttillstånd och humörstörningar, inklusive ångest, depression och panikångest ^4-6, som har satts i samband med förändrad funktion hypothalamic- hypofysadrenal (HPA) axel ^7-10. Exponering för tidiga liv stress eller trauma är en betydande riskfaktor för att utveckla HPA avvikelser och tillhörande kroniska smärtsyndrom ^10,11 och, som sådan, rapporterar en betydande undergrupp av patienter med funktionella bäckensmärttillstånd ha upplevt negativa barndom händelser såsom övergrepp eller försummelse ^12-14.

Gnagare modeller av neonatal maternal separation (NMS), vilket innebär att ta bort valparna från sin mor under en viss tid under preweaning perioden, har använts under de senaste två decennierna för att studera resultaten av tidiga liv stress. I allmänhet, har NMS visats öka HPA-axeln aktivering och resulterande ångestliknande beteenden, genom att direkt påverka genuttryck i hypotalamus, samt störa nedströms reglering från limbiska strukturer ^15-18. Störningar av korrekt HPA-axeln funktion har visat sig bidra till ökad kolorektal ^19-22 </sup> Och vaginal ¹⁶ känslighet visas av gnagare NMS modeller, men trots omfattande karakterisering av den långsiktiga effekten av postnatal inflammation i urinblåsan ^23-25, har effekterna av tidiga liv stressen till stor del gått unstudied i urogenitalorganen. Därför kommer följande studie beskriver hur man utför NMS hos möss och senare utvärdera perigenital mekanisk känslighet och mastcellinfiltration / aktivering i prostatan att kontrollera användningen av manliga NMS möss som en preklinisk modell för CP / CPP.

Av alla de diagnostiserade kroniska bäckensmärttillstånd, är CP / CPP kanske minst välkänt och kännetecknas syndrom, trots att de har en livstidsprevalens på cirka 14% ²⁶ och årliga patientens kostnader uppskattas till $ 4400 (dubbelt så stor som ländryggssmärta eller reumatoid artrit ^27). Patienter med CP / CPP rapport smärta i mellangården, ändtarm, prostata, penis, testiklar, och / eller buk ^28, uppleva en hiGher grad av psykisk stress än kontrollpatienter ^29, och vanligt förekommande med symtom på eller diagnostiseras med comorbid kronisk bäckensmärta eller humörstörningar ^5,29-31. Återkommande infektion, läckande epitel, neurogen inflammation och autoimmunitet har alla surmised som potentiella bakomliggande orsaker till CP / CPP ^2,32,33, samt mastcellsaktivering och degranulering ^34. Uttryckt prostatasekret från män med CP / CPP hade ökat mastcells tryptas och nervtillväxtfaktor (NGF) nivåer ^34, och en senare studie bekräftade att tryptas och karboxipeptidas A (CPA3), en markör för mastcellsaktivering, har också ökat i urin av CP / CPP patienter ^35. Den potentiella roll mastceller i uppkomsten och upprätthållandet av CP / CPP har varit ett stort fokus för djurförsök på detta syndrom hittills. Den vanligast användes gnagarmodell används för att studera CP / CPP är en experimentell autoimmun prostatit (EAP) modell allmbetade genom subkutan injektion av prostata antigen i fullständigt Freunds adjuvans, vilket resulterar i varierande grader av prostatainflammation beroende på art och stam som används ^34,36-39. Mast cellinfiltration och aktivering / degranulering har visat sig öka efter induktion av EAP ^34,35,40. Transgena möss som saknar antingen mastceller ³⁴ eller tryptas receptorn PAR2 ³⁵ utvecklar inte prostata taktik känslighet efter EAP, till skillnad från vildtyp EAP möss. Även om detta preklinisk modell replikerar många av de egenskaper hos mänskliga CP / CPP, är induktionsprotokollet inte ett tecken på människans villkor, som har ett mångsidigt etiologi och ofta inte innebär direkt inflammation, infektion eller skada prostatan.

Inverkan av tidiga liv stress på utvecklingen av CP / CPP hos människa har till stor del gått undersöks inte; Men en studie av Hu et al. ^41, visade att mign som rapporterade en historia av barndomen fysiska, känslomässiga och / eller sexuella övergrepp var betydligt mer benägna att uppleva symtom som tyder på CP / CPP. Dessutom visade de att både smärta och urin poäng var förhöjd hos patienter med en historia av fysisk och psykisk misshandel. Vi har tidigare visat att samma NMS paradigm i C57BL / 6-möss producerar vaginala överkänslighet och onormal genexpression i både slidan och urinblåsan tyder på dysfunktionell HPA-axeln utgång ^16. Detta bevis i kombination med den höga förekomsten av CP / CPP patienter med andra sjukdomstillstånd ^42, inklusive IC / PBS och humörstörningar, som tydligare har visat sig vara kopplat till tidiga liv spännings exponering ^12-14, ger grunden för att använda en NMS modell för att undersöka CP / CPP i möss.

Protocol

Alla försök som beskrivs i detta protokoll överensstämmer med NIH riktlinjer i enlighet med de riktlinjer som anges av University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Neonatal Maternal Separation (NMS) Övervaka gravida dammar dagligen för kull födda. Obs: Dagen kullen föds anses P0. På P1, ta bort dammen från buren och placera i en ren sekundära behållaren. Gnid en handfull strö mellan rena-handsk…

Representative Results

Möss som har genomgått NMS visade beteende bevis tyder på CP / CPP. Vid testning med en graderad serie av von Frey monofilament, 8 veckor gamla NMS möss (n = 4) visas perigenital mekanisk allodyni jämfört med naiva motsvarigheter (n = 5, fig 2). Detta framgår som en signifikant minskning (p <0,01, t-test) i den mekaniska återtagströskel som framkallade en positiv beteende svar, redovisas som en rask ryck eller hoppa som svar på monofilament ansökan eller slickar eller bitande bete…

Discussion

Detta protokoll ger metodik för användning av neonatal stress i form av NMS, att inducera symptomologi indikerar CP / CPP hos vuxna hanmöss. Som vuxna, de NMS möss uppvisar betydande perigenital mekanisk allodyni, samt bevis på mastcelldegranulering i prostatavävnad. Användningen av NMS är ett nytt sätt att utveckla en preklinisk modell av CP / CPP att det replikerar tidiga liv stress som ofta rapporteras av patienter med kronisk bäckensmärta ^12-14, samt att införliva en icke-invasiv induktion, so…

Materials

Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 mL
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.