El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina
Summary
El objetivo de este video es demostrar cómo llevar a cabo la extracción de ADN automatizado de parafina embebido (FFPE) referencia las líneas celulares estándar fijado en formol y gotita digital de PCR (ddPCR) análisis para detectar mutaciones raras en un entorno clínico. La detección de mutaciones en muestras de FFPE demuestra la utilidad clínica de ddPCR en muestras FFPE.
Abstract
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Introduction
La acumulación de mutaciones genéticas en genes reguladores clave altera la programación normal de las células como la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia, que conduce al cáncer 1. La vía RAS-RAF quinasa MAP media las respuestas celulares a las señales de crecimiento. Mutaciones oncogénicas BRAF pueden resultar de mutaciones del conductor en el gen BRAF, que pueden causar la BRAF oncoproteína para convertirse hiperactiva 2. Las mutaciones en el gen BRAF también dan lugar a la señalización aguas abajo hiperactiva MEK y ERK 3, que, a su vez, conduce a un crecimiento celular excesivo y la proliferación independiente de factor de crecimiento mediada por la regulación 4-6.
Varias herramientas están disponibles para perfilar mutación del ADN, como en tiempo real mutaciones BRAF V600E cuantitativos en fijado en formol, embebidos en parafina (FFPE) referencia las líneas celulares estándar por ddPCR. ddPCR es un método basado en la PCR para la cuantificación absoluta-ofreciendo una mayor precisión en comparación con el tiempo real convencional de PCR cuantitativa (qPCR) 7,8. ddPCR también proporciona mayor poder de resolución y la precisión para la detección de mutaciones raras en plantillas de ADN, lo que permite la investigación del cáncer más informativo y diagnóstico 9. Las ventajas adicionales de ddPCR sobre qPCR convencional incluyen su mayor sensibilidad y precisión cuando se estudia el número de copias bajo plantilla 10-12. En este documento, un protocolo para la extracción automática de ADN de referencia FFPE líneas celulares estándar, seguido por la determinación de la presencia o ausencia de mutaciones BRAF V600E por ddPCR se demuestra. También se describen el uso de software para el análisis de datos y una representación gráfica de los resultados. Todo el procedimiento es relativamente simple y totalmente depende del número de muestras que se perfilados y el número de máquinas de PCR y ddPCR convencionales disponibles.
El siguiente protocolo describe los procedimientos estándar para BR FFPE de referencia líneas celulares estándar AF V600E-positivos (HD598, HD593, HD617, HD273 y de tipo salvaje (WT)) se realiza en un instrumento totalmente automatizado usando el protocolo Tissue Sistema de Preparación de (TPS). Posteriormente, se analizaron muestras de ADN aisladas de la presencia de mutaciones BRAF V600E utilizando sistema ddPCR. Análisis de la mutación se realiza después se han perfilado todas las muestras y los datos se ha cargado en el software de análisis de datos. Dependiendo del número de muestras / grupos estudiados, análisis de datos puede requerir de una a varias horas. El componente experimental de la metodología requiere precisión en la manipulación de ADN yrológicos Pipetas y pipetas, un video JoVe Educación Ciencia explicar más acerca sobre el contexto de pipeteo "> pipeteo en placas de 96 pocillos, mientras que el análisis de datos se realiza mediante software.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este sentido, destacamos la aplicabilidad de ddPCR y el aislamiento de ADN a partir de muestras de líneas celulares estándar FFPE de referencia para una evaluación específica de mutación genética. En este estudio, se utiliza TPS método de aislamiento de ADN automatizado que se puede adaptar fácilmente y automatizado, y tiene capacidad para un máximo de 48 muestras diferentes de forma simultánea, lo que permite más grandes experimentos a escala y una menor variabilidad. Una de las limitaciones del aislamien…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación y Desarrollo para la Sociedad de la Fundación Nacional de Investigación (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y planificación de futuro (Grant No. 2013M3C8A1075908).
Materials
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
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