Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie
Summary
Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.
Abstract
Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.
Introduction
De accumulatie van intracellulaire tau amyloids definieert tauopathieën zoals de ziekte van Alzheimer. In de vroege stadia ziekte pathologie is algemeen gelokaliseerd op discrete gebieden van de hersenen, maar met ziekteprogressie, pathologie onveranderlijk verspreidt zich over verschillende neurale netwerken 1-5. Accumuleren bewijs suggereert transcellulaire verspreiding van giftige eiwit aggregaten ten grondslag ligt aan deze pathologie (herzien in 10/06). In dit model worden proteopathic zaden (bv, tau) vrijgelaten uit de donorcellen en voer naburige cellen, transformeren inheemse tau-eiwit in de vorm misfolded via templated conformationele verandering 11-15. De hier beschreven bepaling werd ontwikkeld om dergelijke zaaien activiteit gevoelig detecteren. Het is compatibel met recombinant eiwit en biologische monsters en maakt kwantificering van minuut niveaus van proteopathic zaaien activiteit 16.
HEK 293T-cellen die stabiel tot expressie tau herhaal domain (RD) met de ziekte- geassocieerde P301S mutatie gefuseerd aan ofwel CFP en YFP (hierna tau-RD-CFP / YFP cellen) dienen als stabiele biosensor van zaaien activiteit. Aangezien proteopathic zaden, de cellen behouden tau als een oplosbaar monomeer, en niet betekenisvol achtergrond FRET. Spontane opname of liposomen gemedieerde transductie van tau zaden in cellen, resulteert echter in RD-CFP en YFP RD-aggregatie, welk een FRET signaal dat wordt gemeten tussen enkele cellen via flowcytometrie produceert.
Talrijke bestanddelen van deze test werden om de gevoeligheid verhogen en verlagen variabiliteit. Een monoklonaal cellijn met een 1: 1 RD-CFP / YFP expressie verhouding werd gekozen, omdat het optimale signaal: ruis. Om de gevoeligheid te verhogen, fosfolipiden worden gebruikt om zaden te voeren direct in cellen (hoewel biologische mechanismen te bestuderen van opname, kan deze worden weggelaten). Tenslotte flowcytometrie monitors FRET op populatieniveau en een enkele cel level, in tegenstelling tot andere eiwitten aggregatie-assays. Het eindresultaat maatregel geïntegreerde FRET dichtheid sterk kwantitatief en neemt zowel het aantal cellen met aggregatie, en de mate waarin aggregatie heeft plaatsgevonden binnen elke cel. Al deze geoptimaliseerde parameters verhogen de gevoeligheid en reproduceerbaarheid te verzekeren.
Dit systeem werd onlangs gebruikt in een uitgebreide studie in transgene muizen P301S tauopathie 17 dat de temporele ontstaan en de progressie van tau zaaien activiteit ten opzichte van andere veelgebruikte tau pathologische markers (bijv, MC1, AT8, PG5 en ThioflavinS) geëvalueerd. Seeding activiteit veruit de oudste en meest robuuste marker van tau pathologie geëvalueerd voorafgaand histologische detectie tenminste 6 weken. Seeding activiteit verschijnt 1,5 maanden progressief toeneemt met de leeftijd, hetgeen een oorzakelijke rol proteopathic zaden in het ontstaan en / of de progressie van neurodegeneratie 16.
e_content "> Nauwkeurige kwantificering van minieme hoeveelheden entmateriaal uit biologische monsters studies progressie vroege ziekte te volgen te vergemakkelijken. Door verkorting proces duur en het mogelijk gebruik van jonge dieren, kan dit de efficiëntie en nauwkeurigheid van preklinische dierproeven verhogen. Bijvoorbeeld, in de P301S muis eerder beschreven, kan loodverbindingen zoals geleverd reeds 4-6 weken (onmiddellijk voor of bij het begin van zaaien activiteit) en gecontroleerd op werkzaamheid 2-4 weken later. De test dient nauwkeurig verminderingen van zaaien kwantificeren activiteit. FRET doorstroomcytometrie is in vitro screening toepassingen. Bijvoorbeeld, anti-tau reagentia (bijvoorbeeld antilichamen, kleine moleculen, etc.) kan snel worden getest op hun vermogen te blokkeren zaaien inductie direct in kweek met behulp van recombinant tau aggregaten of hersenen afgeleide lysaten als kiem bron (figuur 5). Bij deze opstelling, wanneer entmateriaal bereid afperiment duurt slechts drie dagen in beslag, met inbegrip van data-analyse. De snelle kwantificering van proteopathic zaaien activiteit kan aldus veel studies van neurodegeneratie vergemakkelijken.Protocol
Representative Results
Discussion
De FRET flowcytometrie systeem hier beschreven is een krachtig hulpmiddel voor het snel en kwantitatief beoordelen van tau zaaien activiteit. Het vereist slechts een matige celkweek ervaring en een praktische kennis van FRET en flowcytometrie. Andere zaaien assays, zoals Thioflavine T – waarbij vertoont verbeterde fluorescentie indien gebonden aan beta sheet structuur – omslachtig en vereisen een zuivere, recombinant eiwit substraat. Bovendien zaaien in vitro assays voor tau slechts semi-kwantitatief en in het …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).
Materials
| TBS | Sigma | T5912 |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 |
| 15 mL conical tube | USA Scientific | 1475-0501 |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 |
| 1.5 mL tubes | USA Scientific | 1615-5510 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| 50 mL Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 |
| 25 mL reagent resevoirs | VWR | 41428-954 |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | |
| 20 uL pipet tips | Rainin | GPS-L10 |
| 200 uL pipet tips | Rainin | GPS-250 |
| 1 mL pipet tips | Rainin | GPS-1000 |
| 200 uL pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 |
| 5 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 |
| 10 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 |
| 25 mL Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer’s disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer’s Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer’s Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochimie. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
