Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie
Summary
Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.
Abstract
Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.
Introduction
Die intrazelluläre Akkumulation von tau Amyloide definiert Tauopathien, wie Alzheimer-Krankheit. In frühen Krankheitsstadien, wird Pathologie allgemein auf diskreten Bereichen des Gehirns lokalisiert ist, aber mit Fortschreiten der Krankheit, Pathologie sind immer an unterschiedliche neuronale Netzwerke 1-5 ausbreitet. Mehr deutet darauf hin transzellulären Ausbreitung toxischer Proteinaggregaten zugrunde liegt diese Pathologie (in 6-10 prüft). In diesem Modell werden proteopathic Samen (zB tau) von Spenderzellen freigesetzt und geben Nachbarzellen, die Umwandlung nativen Tau-Protein in die fehlgefalteten Form über templated Konformationsänderung 11-15. Der hier beschriebene Assay wurde entwickelt, um solche Aussaat Aktivität empfindlich detektieren. Es ist mit einem rekombinanten Protein und biologischen Proben kompatibel und ermöglicht die Quantifizierung von Minute Ebenen proteopathic Aussaat Aktivität 16.
HEK 293T-Zellen, die stabil exprimieren tau repeat domain (RD), das die krankheitsassoziierte Mutation P301S entweder GFP oder YFP fusioniert (nachstehend tau-RD-CFP / YFP-Zellen bezeichnet) dienen als stabile Biosensor seeding Aktivität. In Abwesenheit von proteopathic Samen, die Zellen aufrechtzuerhalten tau als lösliches Monomer und keinen nennenswerten Hintergrund FRET. Spontane Aufnahme oder die Liposomen-vermittelte Transduktion tau Samen in Zellen resultiert jedoch in RD-CFP und YFP RD-Aggregation, die eine FRET-Signals, die innerhalb einzelner Zellen über Durchflusszytometrie gemessen wird erzeugt.
Zahlreiche Komponenten dieses Tests wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und verringern die Variabilität. Ein monoklonaler Zelllinie mit einem 1: RD-CFP / YFP Expressionsverhältnis 1 wurde ausgewählt, da sie eine optimale Signal: Lärm. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit, sind Phospholipide verwendet werden, um Samen einzuführen direkt in Zellen (wenn auch in biologischen Mechanismen der Aufnahme zu studieren, kann diese weggelassen werden). Schließlich Durchflusszytometrie Monitoren FRET auf Bevölkerungsebene und einer einzelnen Zelle Ebene, im Gegensatz zu anderen Proteinaggregation Assays. Das endgültige Ergebnis zu messen, integrierte FRET Dichte ist hoch quantitative und gehen sowohl die Zahl der Zellen mit Aggregation und dem Grad der Aggregation innerhalb jeder Zelle aufgetreten. Alle diese optimierten Parameter zu verbessern Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
Dieses System wurde vor kurzem in einer umfassenden Studie an transgenen Mäusen P301S Tauopathie 17, die die zeitliche Entstehung und Progression von Tau-Seeding-Aktivität im Vergleich zu anderen gängigen tau pathologischen Markern (zB MC1, AT8, PG5 und Thioflavinen) bewertet beschäftigt. Seeding-Aktivität ist bei weitem der frühesten und robusten Marker der tau-Pathologie bewertet vorhergehenden histologischen Nachweis von mindestens 6 Wochen. Seeding Aktivität scheint bei 1,5 Monaten steigt progressiv mit dem Alter zu, was auf eine kausale Rolle der proteopathic Samen bei der Entstehung und / oder Progression der Neurodegeneration 16.
e_content "> Genaue Quantifizierung von Minuten Levels von Saatgut aus biologischen Proben können Studien, die Anfang der Krankheitsfortschritt überwachen zu erleichtern. Durch die Verkürzung Studiendauer und ermöglicht Verwendung von jüngeren Tieren, könnte dies die Effizienz und Genauigkeit der präklinischen Tierversuchen zu erhöhen. Zum Beispiel in das P301S Maus zuvor beschrieben, konnten Leitstrukturen so früh wie 4-6 Wochen geliefert werden (unmittelbar vor oder am Beginn der Aussaat Aktivität) und zur Wirksamkeit von 2-4 Wochen beobachtet. Die Bestimmung ist genau keine Verringerungen der Aussaat zu quantifizieren Aktivität. FRET Durchflusszytometrie wurde in vitro Screening-Anwendungen. Zum Beispiel können anti-tau-Reagenzien (zB Antikörper, von kleinen Molekülen etc.) schnell auf ihre Fähigkeit Impfen Induktion direkt in Kultur unter Verwendung von entweder rekombinanter tau zu Block prüfenden Aggregate oder Gehirn stamm Lysaten als Keimquelle (Abbildung 5). Mit diesem Setup einmal Keimmaterial hergestellt wird, eine Ex-Experiment dauert nur drei Tage, um abzuschließen, einschließlich der Datenanalyse. Die schnelle Quantifizierung von proteopathic Aussaat Aktivität kann somit zu erleichtern viele Studien der Neurodegeneration.Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene FRET Durchflusszytometrie-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die schnelle und quantitative Beurteilung tau Aussaat Aktivität. Es erfordert nur moderate Zellkulturerfahrung und Grundkenntnisse in FRET und Durchflusszytometrie. Andere Seeding-Assays, wie Thioflavin T – die verstärkte Fluoreszenz zeigt, wenn es um Beta-Faltblatt-Struktur gebunden – sind aufwendig und erfordern ein reines, rekombinantes Protein-Substrat. Zusätzlich kann in vitro Aussaat Assays für tau …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).
Materials
| TBS | Sigma | T5912 |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 |
| 15 mL conical tube | USA Scientific | 1475-0501 |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 |
| 1.5 mL tubes | USA Scientific | 1615-5510 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| 50 mL Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 |
| 25 mL reagent resevoirs | VWR | 41428-954 |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | |
| 20 uL pipet tips | Rainin | GPS-L10 |
| 200 uL pipet tips | Rainin | GPS-250 |
| 1 mL pipet tips | Rainin | GPS-1000 |
| 200 uL pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 |
| 5 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 |
| 10 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 |
| 25 mL Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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