Purificação de embarcações do cérebro do rato

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

No cérebro, a maior parte do sistema vascular consiste de uma barreira selectiva, a barreira sangue-cérebro (BBB) ​​que regula a permuta de moléculas e células do sistema imunológico entre o cérebro e o sangue. Além disso, a enorme demanda metabólica neuronal requer um regulamento momento-a-momento de fluxo sanguíneo. Notavelmente, anormalidades destes regulamentos são características etiológicos da maioria das patologias cerebrais; incluindo o glioblastoma, acidente vascular cerebral, edema, epilepsia, doenças degenerativas (ex: doença de Parkinson, doença de Alzheimer), tumores cerebrais, bem como das condições inflamatórias tais como esclerose múltipla, meningite e disfunções cerebrais induzidas por sepsia. Assim, a compreensão dos eventos de sinalização que modulam a fisiologia vascular cerebral é um grande desafio. Muito conhecimento sobre as propriedades moleculares e celulares de vários tipos de células que compõem o sistema vascular cerebral pode ser adquirida a partir da cultura primária ou separação de células a partir de tecido cerebral dissociado recentemente. Contudo,Propriedades tais como polaridade celular, a morfologia e as relações intercelulares não são mantidos em tais preparações. O protocolo que se descrevem aqui é concebido para purificar fragmentos dos vasos do cérebro, ao mesmo tempo manter a integridade estrutural. Mostra-se que os vasos isolados são constituídos por células endoteliais seladas por junções apertadas, que são rodeadas por uma lâmina basal contínua. Pericitos, células musculares lisas, bem como as membranas de astrócitos endfeet perivasculares permanecem ligados à camada endotelial. Finalmente, nós descrevemos como a realização de experimentos de positividade em vasos cerebrais purificados.

Introduction

O funcionamento adequado do sistema nervoso central (SNC) requer um ambiente extracelular altamente regulada, e as demandas metabólicas são enormes em comparação com outros órgãos ^1. O SNC também é extremamente sensível a uma vasta gama de produtos químicos, geralmente inofensivo para órgãos periféricos, mas a ela, neurotóxica. Para assegurar um funcionamento correcto, a maior parte do "vasculatura SNC forma uma barreira endotelial; a barreira sangue-cérebro (BBB), que controla o fluxo de moléculas e iões, bem como a passagem de células do sistema imunológico entre o sangue e o cérebro, mantendo assim a homeostase devida ^2, mas também limitar a entrada de drogas terapêuticas, os tratamentos que impedem assim de distúrbios neurológicos ^3. Ao nível celular, a certificação é sustentada principalmente por extensos junções apertadas entre as células endoteliais, expressão polarizada de transportadores de efluxo e uma taxa muito baixa transcitose ^4. Propriedades e as funções da certificação são principalmente induzida por NEcélulas ighboring ^4. Em particular, pericitos desempenhar um papel importante na indução e manutenção da certificação ^5,6. Sendo células contrácteis, pericitos também regular o fluxo sanguíneo como fazem os ⁷ células de músculo liso circundantes grandes vasos. Finalmente, astrócitos, as principais células gliais do cérebro, enviar grandes processos chamados endfeet em torno da maioria da vasculatura cerebral ⁸ e modula a certificação integridade e quiescência imune ^9, a transferência de metabolitos para neurónios ^{de 10,} e induzir o acoplamento apertado entre a actividade neuronal e o fluxo de sangue ^11,12.

A capacidade para estudar as propriedades moleculares e celulares do sistema vascular cerebral é crucial para caracterizar melhor a sua contribuição para a fisiologia do cérebro e fisiopatologia. Para fazer face a esta questão, as estratégias para isolar sistema vascular cerebral do cérebro têm sido desenvolvidos, que permitem a preparação de fragmentos de vasos cerebrais intactas. Cerebral navio purification foi inicialmente descrita usando cérebros de bovinos ¹³ e melhorado e adaptado para outras espécies, em particular roedores ^14. Neste último estudo, a utilização de filtros de tamanho variável foi introduzido para separar vasos cerebrais em fracções enriquecidas em recipientes de diferentes diâmetros. Curiosamente, em tais preparações, as células endoteliais mantiveram suas propriedades metabólicas ^15, funcionalidade transportador ^{16 e 17} de polarização. Aqui, descrevemos detalhadamente este protocolo e ainda demonstrar que os navios isolados reter a maior parte de seu em estruturas in situ. As células endoteliais permanecem ligados por junções apertadas e rodeado por uma lâmina basal contínua. Pericitos e células musculares lisas permanecem ligadas à camada endotelial, bem como as membranas de astrócitos perivasculares. No entanto, astrócitos, células microgliais, neurónios e os oligodendrócitos são eliminados. Finalmente, descreve-se um procedimento para executar imunocoloração em vasos cerebrais isoladas. </p>

Até agora a maioria dos estudos moleculares e celulares relacionadas com o sistema cerebrovascular foram realizados em células dos vasos cerebrais purificados dissociadas utilizando estirpes repórter do mouse específicos de células ou procedimentos baseados imunocoloração ^18,19 classificando-célula. Embora estas técnicas permite o isolamento de populações de células vasculares cerebrais quase puros, células isoladas perder completamente a sua morfologia in situ e interacções, que por sua vez, afecta grandemente as suas propriedades moleculares e celulares. O protocolo aqui descrito, permitindo o isolamento de fragmentos cerebrovasculares inteiras sem a necessidade de anticorpos específicos ou manchas de ratinhos transgénicos, oferece uma boa alternativa, a estrutura global dos vasos cerebrais isoladas é conservada, assim, diminuir repercussões sobre as suas propriedades moleculares. Isolado navios poderiam, então, ser usado para estudar a atividade do gene, a síntese de proteínas e regulação no BBB, como recentemente descrita ^20,21 </sup>. Finalmente, em relação ao laser captura microdissection ^22,23 o presente protocolo é barato, fácil de executar e rapidamente adaptável em qualquer laboratório.

Protocol

1. Soluções e Materiais Preparar soluções de vasos isolamento: B1, adicionar 1,5 mL de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, adicionar 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, adicionar 1 g de BSA para 100 ml de B1. Modificar o suporte do filtro cortando o fundo fora da parte superior de enroscar. Preparar soluções de positividade: solução de fixação, paraformaldeído a 4% em PBS pH 7,4; Permeabilização / solução de bloqueio, soro de cabra diluído a 5% e Triton X100 a 0,25% em PBS pH …

Representative Results

Aqui, descrevemos um protocolo permitindo o isolamento mecânica dos vasos cerebrais 14. Figura 1 resume as principais etapas desta técnica. A arquitetura dos vasos cerebrais é complexa e inclui vários tipos de células, isto é, células endoteliais seladas por junções apertadas e pericitos, rodeados por células de músculo liso, e os processos de astrócitos do pé 9. Assim, após o isolamento dos vasos cerebrais, que teve como objetivo caracterizar a estrutura dos…

Discussion

A barreira sangue-cérebro regula a passagem de substâncias fisiológicas dentro e fora do sistema nervoso central e o protege contra substâncias potencialmente nocivas presentes no sangue. Ele está envolvido em várias patologias do SNC, incluindo doenças neurodegenerativas ^{2 e} tumores cerebrais ^28. A baixíssima permeabilidade da certificação também dificulta a passagem de agentes terapêuticos que visam células neurais e ao desenvolvimento de métodos que pretendem abrir reversível a ce…

Materials

Tissue Grinder Size C	Thomas scientific	3431E25
centrifuge 5415 R	Eppendorf
centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000	Leica	LED1000
low binding tips (P1000)	Sorenson BioScience	14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk	Millipore	SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk	Millipore	NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk	Millipore	NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing	Sutter Instrument	B150-86-7.5
Microscope Slides	Thermo Scientific	1014356290F
Cover Slips, Thickness 1	Thermo Scientific	P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap	Thermo Scientific	AB-0266
PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft)	Sigma	P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Life technology	14175-129
HEPES (1M)	Life technology	15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000	Sigma	31390
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
PBS 10X	Euromedex	ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Triton™ X-100	Sigma	X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma	14533
Mounting medium Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100	Life technology	I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400	kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)	Life technology	33-9100	dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)	Sigma	A2547	dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)	Sigma	G3893	dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)	Sigma	A5971	dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)	BD Biosciences	610061	dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)	Millipore	AB9610	dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)	provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.		dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)	Wako	019-19741	dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A11029	dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate	Life technology	A11034	dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A21424	dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate	Life technology	A21429	dilution 1:2000