Purification de souris vaisseaux cérébraux

Summary

Nous décrivons un protocole permettant la purification du compartiment vasculaire du cerveau de la souris. Les vaisseaux cérébraux isolés comprennent des cellules endothéliales reliées par des jonctions serrées et entourées d’une lame basale continue, des péricytes, des cellules musculaires lisses vasculaires, ainsi que des membranes astrogliales périvasculaires.

Abstract

Dans le cerveau, la majeure partie du système vasculaire est constituée d'une barrière sélective, la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui régule l'échange des molécules et des cellules du système immunitaire entre le cerveau et le sang. En outre, l'énorme demande métabolique neuronale nécessite un règlement d'instant en instant de la circulation sanguine. Notamment, des anomalies de ces réglementations sont les caractéristiques étiologiques de la plupart des pathologies du cerveau; y compris un glioblastome, un accident vasculaire cérébral, l'oedème, l'épilepsie, les maladies dégénératives (ex: la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer), les tumeurs cérébrales, ainsi que des affections inflammatoires telles que la sclérose en plaques, la méningite et dysfonctionnements cérébraux induite par le sepsis. Ainsi, la compréhension des événements de signalisation modulant la physiologie vasculaire cérébral est un défi majeur. Beaucoup de perspicacité dans les propriétés cellulaires et moléculaires des différents types de cellules qui composent le système vasculaire cérébral peut être acquise à partir de la culture ou de la cellule primaire de tri du tissu cérébral fraîchement dissociée. cependant,propriétés telles que la polarité cellulaire, la morphologie et les relations intercellulaires ne sont pas maintenus dans de telles préparations. Le protocole que nous décrivons ici est conçu pour purifier des fragments des vaisseaux du cerveau, tout en maintenant l'intégrité structurelle. Nous montrons que des vaisseaux isolés constitués de cellules endothéliales scellées par des jonctions serrées qui sont entourés par une membrane basale continue. Pericytes, cellules musculaires lisses, ainsi que les astrocytes périvasculaires membranes de endfeet restent attachés à la couche endothéliale. Enfin, nous décrivons comment effectuer des expériences de immunocoloration sur les vaisseaux cérébraux purifiés.

Introduction

Le bon fonctionnement du système nerveux central (SNC) nécessite un environnement extracellulaire très réglementé, et ses besoins métaboliques sont énormes par rapport à d'autres organes ^1. Le CNS est aussi extrêmement sensibles à un large éventail de produits chimiques, généralement inoffensifs pour les organes périphériques, mais à elle, neurotoxique. Pour assurer un fonctionnement correct, la majeure partie du système vasculaire du SNC »forme une barrière endothéliale; la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui commande l'écoulement des molécules et des ions ainsi que le passage des cellules immunitaires entre le sang et le cerveau, ce qui maint....

Protocol

1. Les solutions et matériaux

1. Préparer des solutions de navires d'isolement: B1, ajouter 1,5 ml de HEPES 1M à 150 ml de HBSS; B2, ajouter 3,6 g de dextrane à 20 ml de B1; B3, ajouter 1 g de BSA pour 100 ml de B1.
2. Modifier le porte-filtre en coupant le fond de la partie supérieure de vissage.
3. Préparer des solutions de immunocoloration: solution de fixation, 4% de paraformaldehyde dans PBS pH 7,4; Perméabilisation / solution de blocage, diluer du sérum de chèvre à 5% de Triton X100 et à 0,25% dans du PBS pH 7,4.
   Remarque: La fixation dépend du type d'anticorps primaires utilisés.

2. Dissecti....

Results

Ici, nous décrivons un protocole permettant l'isolation mécanique des vaisseaux du cerveau ^14. La figure 1 résume les principales étapes de cette technique. L'architecture des vaisseaux cérébraux est complexe et comprend plusieurs types de cellules, à savoir, les cellules endotheliales scellées par des jonctions serrées et les pericytes, entourés par les cellules musculaires lisses, et les procédés pour les pieds ⁹ astrocyte. Ainsi, suite à l'isolement des vaissea.......

Discussion

La barrière hémato-encéphalique régule le passage de substances physiologiques dans et hors du système nerveux central et le protège contre des substances potentiellement nocives présentes dans le sang. Elle intervient dans plusieurs pathologies du système nerveux central, incluant les maladies neurodégénératives ^{2 et 28} tumeurs du cerveau. Le très faible perméabilité de la BHE entrave également le passage d'agents thérapeutiques ciblant les cellules neuronales et le développement de méthodes qui ont l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Broyeur de tissus Taille C	Thomas scientific	3431E25
centrifugeuse 5415  ; R	Eppendorf
centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000320
Stéréomicroscope modulaire haute performance	Leica	MZ6
offre des pointes Leica LED1000	Leica	LED1000
faible liaison de haute qualité (P1000)	Sorenson BioScience	14200T
Swinnex 47 mm porte-filtre PP 8/pk	Millipore	SX0004700
Disque filtrant en nylon Hydrophile 20 µ ; m 47 mm 100/Pk	Millipore	NY2004700
Disque filtrant en nylon Hydrophile 100 µ ; m 47 mm 100/Pk	Millipore	NY1H04700
Wall Borosilicate Tubing	Sutter Instrument	B150-86-7.5
Lames de microscope	Thermo Scientific	1014356290F
Lames de couverture, Épaisseur 1	Thermo Scientific	P10143263NR1
0,2 ml Tubes à paroi mince et capuchon bombé	Thermo Scientific	AB-0266
; PARAFILM M (cylindre 4 po. & fois 125 pi)	Sigma	P7793-1EA
HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge phénol	Life technology	14175-129
HEPES (1M)	Life technology	15630056
Dextran de Leuconostoc spp. Mr ~70,000	Sigma	31390
Albumine sérique bovine	Sigma	A2153
10x PBS	Euromedex	ET330
16 % Formaldéhyde (p/v), sans méthanol  ;	Thermo Scientific	28908
Triton X-100	Sigma	X100
bisBenzimide H 33342 trichlorhydrate (Hoechst)	Sigma	14533
Milieu de montage Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Isolectine GS-IB4 de Griffonia simplicifolia, conjugué Alexa Fluor 488 ; Dilution 1/100	Life technology	I21411
Agrin (lapin) ; dilution 1/400	aimablement fournie par le Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (souris, clone 1A12)	Life technology	33-9100	dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (souris, clone 1A4)	Sigma	A2547	; dilution 1:500
Anti GFAP (souris, clone GA5)	Sigma	G3893	; dilution 1:500
Anti AQP4 (lapin)	Sigma	A5971	; dilution 1:500
Anti Cx43 (souris, clone  ; 2)	BD Biosciences	610061	; dilution 1:500
Anti Olig2 (lapin)	Millipore	AB9610	; dilution 1:200
Anti NF-M (souris)	fourni par le Dr Beat M. Riederer, Université de Lausanne, Suisse.	; dilution 1:10
Anti Iba1 (lapin)	Wako	019-19741	; dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-souris IgG (H+L)	Technologie de vie	d’anticorps A11029	; dilution 1:2 000
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488	Technologie de vie	A11034	; dilution 1:2 000
Alexa Fluor 555 Chèvre Anti-souris IgG (H+L)	Technologie de vie	d’anticorps A21424	; dilution 1:2 000
Anticorps secondaire IgG (H+L) anti-Rabbit IgG (H+L), conjugué Alexa Fluor 555	Technologie Life	A21429	; dilution 1:2 000