Очистка сосудов головного мозга мыши
Summary
We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.
Abstract
В головном мозге, большинство из сосудистой системы состоит из селективного барьера гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который регулирует обмен молекул и клеток иммунной системы между головным мозгом и кровью. Кроме того, огромный спрос нейронов метаболический требует регулирования момента к моменту кровотока. Примечательно, нарушения этих регулировок этиологические признаки большинства патологий головного мозга; в том числе глиобластомы, инсульт, отек, эпилепсия, дегенеративных заболеваний (например: болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера), опухоли головного мозга, а также воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз, менингит и сепсис-индуцированной дисфункции мозга. Таким образом, понимание сигнализации события модуляции цереброваскулярные физиологии является серьезной проблемой. Большая понимание клеточных и молекулярных свойств различных типов клеток, которые составляют систему цереброваскулярные могут быть получены от первичной культуры или сортировки клеток из свежего диссоциированного мозговой ткани. Однако,свойства, такие как клеточной полярности, морфологии и межклеточных отношений не поддерживается в таких препаратах. Протокол, который мы здесь описывать предназначен для очистки фрагментов мозга сосудов, сохраняя структурную целостность. Покажем, что изолированные сосуды состоят из эндотелиальных клеток, герметично плотных контактов, которые окружены непрерывной базальной пластинки. Перициты, гладкомышечные клетки, а также периваскулярные астроцитов endfeet мембраны остаются прикрепленными к эндотелиальный слой. Наконец, мы опишем, как выполнять Иммуноокрашивание эксперименты на очищенных сосудов головного мозга.
Introduction
Правильная работа центральной нервной системы (ЦНС) требует высокой регулируемой внеклеточной среде, и его метаболических потребностей огромны по сравнению с другими органами 1. ЦНС также очень чувствительны к широкому спектру химических веществ, как правило, безвредным для периферических органов, но к ней, нейротоксическое. Для обеспечения правильного функционирования, большинство из "сосудистой ЦНС образует барьер эндотелиальных; гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который регулирует поток молекул и ионов, а также прохождение иммунных клеток между кровью и мозгом, тем самым поддерживая надлежащую гомеостаз 2, но также ограничивает проникновение лекарственных препаратов, тем самым, препятствуя лечения неврологических расстройств. 3 На клеточном уровне, то ВВВ в основном поддерживается обширными плотных контактов между эндотелиальными клетками, поляризованного экспрессии оттока транспортеров и с очень низкой скоростью трансцитоза 4. Свойства и функции ГЭБ, в основном индуцируется пеighboring клетки 4. В частности, перицитов играют важную роль в стимулирования и поддержания ГЭБ 5,6. Будучи сократительных клеток, перициты также регулировать кровоток 7, как это делают клетки гладких мышц, окружающие крупные сосуды. Наконец, астроциты, основные глиальные клетки головного мозга, передавать большие процессы с именем endfeet вокруг большей части головного мозга сосудистой 8 и модулировать целостность ВВВ и иммунной состояние покоя 9, передачу метаболитов к нейронам 10, и индуцируют жесткую связь между нейронной активности и кровоток 11,12.
Возможность изучать молекулярные и клеточные свойства цереброваскулярной системы имеет решающее значение для характеристики лучше свой вклад в физиологии мозга и патофизиологии. Для решения этого вопроса, стратегии изолировать цереброваскулярные системы мозга были разработаны, которые позволяют для подготовки неповрежденных фрагментов мозга сосудов. Церебральный судно рurification изначально описывается с помощью крупного рогатого мозги 13 и улучшены и адаптированы к другим видам, в частности грызунов 14. В этом последнем исследовании, была введена использование фильтров разных размеров, чтобы отделить сосуды головного мозга, чтобы фракции, обогащенные в сосудах разного диаметра. Интересно, что в таких препаратах, эндотелиальные клетки сохранили свои метаболические свойства 15, функциональность транспортер 16 и поляризационные 17. Здесь мы подробно этот протокол и далее показывают, что изолированные сосуды сохраняют большинство своих наблюдений в точке структур. Эндотелиальные клетки остаются связаны плотных контактов и окружен непрерывной базальной мембраны. Перициты и гладкомышечные клетки остаются прикрепленными к эндотелиальный слой, а также периваскулярными астроцитов мембран. Тем не менее, астроциты, клетки микроглии, нейроны и олигодендроциты устранены. Наконец, мы описываем процедуру выполнять иммуноокрашивания на изолированных сосудов головного мозга. </р>
До сих пор большинство из молекулярных и клеточных исследований, касающихся цереброваскулярные системы не были выполнены на очищенных клеток головного мозга судов диссоциированных по мобильному сортировки с использованием конкретных штаммов репортер клеток мыши или процедуры Иммуноокрашивание основе 18,19. Хотя эти методы позволяют для выделения почти чистых популяций клеток цереброваскулярных, изолированные клетки полностью теряют на месте морфологию и взаимодействий, которые, в свою очередь, в значительной степени влияет на их молекулярные и клеточные свойства. Протокол, описанный здесь позволяет для выделения целых цереброваскулярных фрагментов без необходимости специфических антител или трансгенных мышей пятен, предлагает хорошую альтернативу в качестве общей структуры изолированных сосудов головного мозга сохраняется, таким образом, уменьшая воздействие на их молекулярных свойств. Изолированные сосуды затем могут быть использованы для изучения активности генов, синтез белка и регулирования в BBB качестве недавно описал 20,21 </suр>. Наконец, по сравнению с лазерной захвата микродиссекции 22,23 Настоящий Протокол является недорогой, легко выполнять и быстро адаптируется к любому лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
Барьер гематоэнцефалический регулирует прохождение физиологических веществ в и из ЦНС и защищает его от потенциально вредных веществ, присутствующих в крови. Он участвует в нескольких патологий ЦНС, в том числе нейродегенеративных заболеваний 2 и опухолей головного мозга 28.</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Labex MemoLife и по ARSEP (Фонд Pour l'помощник а-ля Recherche сюр-ла-уплотнять ан бляшек)
Materials
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| PBS 10X | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton™ X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2000 |
| Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2000 |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
- Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
- Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -. M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
- Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
- Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
- Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Boulay, A. -. C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
- Boulay, A. -. C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
- Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
- Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
- Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
- Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
- Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
- Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
- Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
- Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
- Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
- Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
- Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
- Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
- Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
- Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
- Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).
