Rensing av musehjerne Vessels

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

I hjernen, det meste av det vaskulære systemet består av en selektiv barriere, blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​som regulerer utveksling av molekyler og immunceller mellom hjerne og blod. Videre den enorme nevronale metabolske etterspørsel krever et øyeblikk til øyeblikk regulering av blodstrøm. Spesielt, avvik i denne forskriften er etiologiske kjennetegner de fleste hjerne patologi; inkludert glioblastom, hjerneslag, ødem, epilepsi, degenerative sykdommer (ex: Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom), hjernesvulster, samt inflammatoriske tilstander som multippel sklerose, meningitt og sepsis-indusert hjernen dysfunksjoner. Dermed forstå signal hendelser moduler den cerebrovaskulær fysiologi er en stor utfordring. Mye innsikt i cellulære og molekylære egenskapene til de ulike celletyper som komponerer cerebrovaskulær system kan oppnås av primær kultur eller celle sortering fra ferske dissosiert hjernevev. Derimot,egenskaper som celle polaritet, morfologi og inter relasjoner er ikke vedlikeholdes i slike preparater. Protokollen at vi beskriver her er laget for å rense hjernen fartøy fragmenter, samtidig opprettholde strukturell integritet. Vi viser at isolerte kar består av endotelceller forseglet med tett veikryss som er omgitt av en kontinuerlig basal lamina. Pericytes, glatte muskelceller, så vel som de perivaskulære astrocytt endfeet membraner forbli festet til endotel-lag. Til slutt beskriver vi hvordan du utfører farging eksperimenter på renset hjernen fartøy.

Introduction

Riktig funksjon av sentralnervesystemet (CNS) krever en svært regulert ekstracellulært miljø, og dens metabolske krav er stor sammenlignet med andre organer ^1. CNS er også meget følsom for et bredt spekter av kjemikalier, generelt ufarlig for perifere organer, men til det, neurotoksisk. For å sikre korrekt funksjon, de fleste av CNS 'blodkar danner en endothelial barriere; blod-hjerne-barrieren (BBB), som kontrollerer strømmen av molekyler og ioner, samt passasje av immunceller mellom blod og hjerne, for derved å opprettholde riktig homeostase ^2, men også å begrense inntrengning av terapeutiske legemidler, og dermed hindrer behandlinger nevrologiske lidelser ^3. På cellenivå, er BBB i hovedsak består av omfattende tett veikryss mellom endotelceller, polarisert uttrykk for efflux transportører og en svært lav transcytose sats ^4. Egenskapene og funksjonene til BBB er hovedsakelig forårsaket av neighboring celler ^4. Spesielt pericytes spiller en viktig rolle ved indusering og vedlikehold av BBB ^5,6. Å være kontraktile celler, pericytes også regulere blodstrøm ⁷ som gjør de glatte muskelcellene rundt store fartøy. Til slutt, astrocytter, de store glialceller i hjernen, sende store prosesser oppkalt endfeet rundt mesteparten av hjernen vaskulaturen ⁸ og modulere BBB integritet og immun quiescence ^9, overføring av metabolittene til nerveceller ^10, og indusere tett kopling mellom neuronal aktivitet og blodstrøm ^11,12.

Muligheten til å studere de molekylære og cellulære egenskapene til cerebrovaskulær system er avgjørende for å karakterisere bedre sitt bidrag til hjernen fysiologi og patofysiologi. For å takle dette spørsmålet, har strategier for å isolere hjernens cerebrovaskulær system er utviklet, som gir mulighet for utarbeidelse av intakte hjerne fartøy fragmenter. Cerebral fartøy purification ble opprinnelig beskrevet ved hjelp av bovin hjerne ¹³ og forbedret og tilpasset til andre arter, særlig gnagere ^14. I denne siste studien, ble bruken av filtre av varierende størrelse innført for å separere hjernen fartøy i fraksjoner anriket på fartøyer med forskjellige diametre. Interessant, i slike preparater, endotelceller holdt sine metabolske egenskaper ^15, transporter funksjonalitet ^{16 og} polarisering ^17. Her beskriver vi i detalj denne protokollen og videre vise at isolerte kar beholde mesteparten av sin in situ strukturer. Endotelceller forbli koblet av tett veikryss og omgitt av en kontinuerlig basal lamina. Pericytes og glatte muskelceller forbli festet til endotel-lag, samt perivaskulær astrocyttkulturer membraner. Imidlertid er astrocytter, mikrogliale celler, nerveceller og oligodendrocytter elimineres. Til slutt beskriver vi en prosedyre for å utføre farging på isolerte hjernen fartøy. </p>

Inntil nå har de fleste av de molekylære og cellulære studier om cerebrovaskulær system har blitt utført på renset hjerne fartøyet cellene dissosiert ved celle-sortering ved hjelp av celle bestemte reporter musestammer eller farging baserte prosedyrer ^18,19. Selv om disse teknikkene tillater isolering av nesten ren cerebrovaskulære cellepopulasjoner, isolerte celler helt mister sin morfologi in situ og interaksjoner, som i sin tur påvirker i stor grad deres molekylære og cellulære egenskaper. Protokollen er beskrevet her, noe som åpner for isolering av hele cerebrovaskulære fragmenter uten behov for spesifikke antistoffer eller transgene mus flekker, tilbyr et godt alternativ som den overordnede strukturen av isolerte cerebrale kar er bevart, og dermed minske konsekvenser for deres molekylære egenskaper. Isolerte kar kan deretter bli brukt for å studere genaktivitet, proteinsyntese og regulering på BBB som nylig beskrevet ^20,21 </sup>. Til slutt, sammenlignet med laser capture mikrodisseksjon ^22,23 protokoll er billig, lett å utføre og raskt tilpasningsdyktig i et hvilket som helst laboratorium.

Protocol

1. Solutions og Materials Forbered isolasjon skipsløsninger: B1, tilsett 1,5 ml HEPES 1M til 150 ml HBSS; B2, tilsett 3,6 g dekstran til 20 ml B1; B3, tilsett 1 g BSA til 100 ml av B1. Endre filterholderen ved å kutte bunnen av den øvre skru del. Forbered immunofarging løsninger: Fixation løsning, 4% Paraformaldehyde i PBS pH 7,4; Permeabilization / blokkeringsløsning, fortynn geiteserum til 5%, og Triton X100 til 0,25% i PBS pH 7,4. Merk: Fiksering er avhengig av typen av pri…

Representative Results

Her beskriver vi en protokoll som åpner for mekanisk isolering av hjernekarene 14. Figur 1 oppsummerer hovedtrinnene i denne teknikk. Arkitekturen i hjernen fartøy er kompleks og inneholder flere celletyper, dvs. endotelceller forseglet av tett veikryss og omgitt av pericytes, glatte muskelceller og astrocyte fot prosesser 9. Således, etter isolering av hjernen fartøy ønsket vi å karakterisere strukturen av rensede skar ved farging som beskrevet i annen del av protok…

Discussion

Blod-hjerne-barrieren regulerer passasjen av fysiologiske stoffer i og ut av CNS og beskytter den mot potensielt skadelige stoffer som er tilstede i blodet. Det er involvert i flere CNS sykdommer, inkludert nevrodegenerative sykdommer ^{2 og} hjernesvulster ^28. Den ekstremt lave permeabilitet av BBB hindrer også passasje av terapeutiske midler rettet mot nerveceller og utvikling av metoder har til hensikt å reversibelt åpne BBB uten noen skadelige konsekvenser for hjernen er et meget aktivt forskni…

Materials

Tissue Grinder Size C	Thomas scientific	3431E25
centrifuge 5415 R	Eppendorf
centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000	Leica	LED1000
low binding tips (P1000)	Sorenson BioScience	14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk	Millipore	SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk	Millipore	NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk	Millipore	NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing	Sutter Instrument	B150-86-7.5
Microscope Slides	Thermo Scientific	1014356290F
Cover Slips, Thickness 1	Thermo Scientific	P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap	Thermo Scientific	AB-0266
PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft)	Sigma	P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Life technology	14175-129
HEPES (1M)	Life technology	15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000	Sigma	31390
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
PBS 10X	Euromedex	ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Triton™ X-100	Sigma	X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma	14533
Mounting medium Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100	Life technology	I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400	kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)	Life technology	33-9100	dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)	Sigma	A2547	dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)	Sigma	G3893	dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)	Sigma	A5971	dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)	BD Biosciences	610061	dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)	Millipore	AB9610	dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)	provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.		dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)	Wako	019-19741	dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A11029	dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate	Life technology	A11034	dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technology	A21424	dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate	Life technology	A21429	dilution 1:2000