Методы по расследованию регулирующей роли малых РНК и рибосомного размещения в<em> Малярийного плазмодия</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

Генетический вариант ответственность за серповидно-клеточная аллеля (ОБД) позволяет эритроциты сопротивляться инфекции паразита малярии, P. тропической. Молекулярная основа этого сопротивления, которая, как известно, многофакторный, остается полностью понимали. Последние исследования показали, что дифференциальное выражение эритроцитов микроРНК, когда перемещается в малярийных паразитов, влияют как на регуляции генов и рост паразита. Эти микроРНК были позже ингибируют перевод мРНК путем формирования химерных РНК, с помощью 5 'РНК слияния с сдержанный подмножеств паразитов мРНК. Вот, методы, которые были использованы для изучения функциональной роли и предполагаемые механизм, лежащий микроРНК эритроцитов на регуляции генов и поступательного потенциала P. тропической, в том числе трансфекции модифицированных синтетических микроРНК в принимающих эритроцитов, будут подробно. Наконец, метод полисом градиент используется для определения степени TRAnslation этих транскриптов. Вместе эти методы позволили продемонстрировать, что Нарушение регуляции уровней эритроцитов микроРНК способствует клеточной внутреннее сопротивление малярии серповидных эритроцитов в.

Introduction

Малярия, вызванная apicomplexan паразитов рода Plasmodium, является наиболее распространенным паразитарным заболеванием человека, в глобальном масштабе заражения примерно 200 миллионов человек каждый год, и в результате чего вокруг 600.000 смертей ^1. Из пяти видов Plasmodium, которые заражают людей, наиболее актуальными для человека заболевания П. тропической и П. трехдневной, из-за их широкого распределения и потенциал для серьезных осложнений малярии. Жизненный цикл малярийного паразита требует инфекции обоих комаров и человека. При запуске зараженного комариных укусов человека, паразиты путешествовать через кровоток в печени, где первоначальный раунд репликации. После разрыва Мерозоиты принимающей гепатоцитов, они заражают окружающих эритроциты, инициируя либо бесполым или сексуального репликации. Неполовой этап репликации, которая длится 48 ч в P. тропической, находится в центре внимания данного исследования, так как она является одновременно источником большей MalАрия симптомы и легко воспроизводятся в лабораторных условиях.

В то время как ряд инициатив в области общественного здравоохранения, в том числе улучшенные противомалярийных терапии, которые несколько снижается бремя малярии в глобальном масштабе, продолжающееся появление устойчивых к лекарствам паразитов представляет проблему для усилий по борьбе с малярией. Одной из областей, которые могут предложить новые терапевтические подходы является изучение того, как различные генетические варианты придают устойчивость к малярии. В эндемичных по малярии районах, разнообразие эритроцитов полиморфизмов довольно часто ^2,3. Эти мутации, с серповидно-клеточная, возможно, наиболее заметным, часто связаны со значительным сопротивлением начала инфекции симптоматическое малярии ^4. Основные механизмы, с помощью которых они вызывают эритроциты сопротивляться инфекции малярии полностью понял. Пораженных эритроцитов с мутациями гемоглобина подлежат расширенной фагоцитоза путем расширения сотовой жесткости и обезвоживания, котороесвязано со снижением вторжения P. Falciparum ^5. НВс аллель влияет также экспрессию белка на поверхности эритроцитов и ремоделирования цитоскелета, далее, ингибирующих развитие паразита ^6,7. Наконец, П. тропической плохо растет в гомозиготном серп (ОБД) эритроцитов ^8,9 в пробирке, предлагая внутренние факторы эритроцитарных сопротивления малярии. Тем не менее, в то время как все эти механизмы, кажется, играют роль, они не в полной мере объяснить механизмы, лежащие серпа устойчивости клеток к малярии.

Одним из потенциальных набор эритроцитарных факторов, которые остаются плохо понятыми является большой бассейн микроРНК, присутствующего в зрелые эритроциты. Микро небольшие некодирующие РНК, 19-25 нт в размерах, которые опосредуют перевод и / или стабильность мРНК мишеней с помощью спаривания оснований в пределах 3 'UTR. Они были вовлечены в контроле млекопитающих иммунные реакции, в том числе подавление OF репликации вируса ¹⁰ и было показано, придают устойчивость к вирусам растений Они также показали, чтобы регулировать несколько эритроцитарных процессы, в том числе эритропоэза ^11,12 и метаболизма железа ^13. Предыдущие исследования выявили богатый и разнообразный население эритроцитов микроРНК, чьи выражение резко изменили в ОБД эритроцитов ^14,15. Так зрелые эритроциты не имеют активного транскрипцию и трансляцию, функциональная роль этих эритроцитов микроРНК, остается неясным. Как значительный материальный обмен происходит между клетки-хозяина и P. тропической во время intraerythrocytic цикла развития (IDC) ^16, было предположение, что изменили профиль микроРНК в HbS эритроцитов может непосредственно способствовать устойчивости малярии клеток-внутренняя.

Эти исследования, в конечном счете привело к развитию трубопровода для выделения, идентификации и функционально исследовать роль человеческого микроРНК в мAlaria паразит, П. тропической, которые показали, что эти хозяева / человека микроРНК, в конечном счете, ковалентно предохранитель, а затем поступательно подавить паразит мРНК стенограммы ^17. Это дало пример первых межвидовой химерных транскриптов, образованных транс-сплайсинга и подразумевает, что эта микроРНК-мРНК синтез может происходить в других видах, в том числе других паразитов. Все трипаносом мРНК транс-сплайсинга с сплайсинга лидера (SL), чтобы регулировать разделение полицистронных транскриптов ^18. Так P. тропической не хватает ортологи для Dicer / назад ^19,20, вполне возможно, что микроРНК эритроцитов захватить подобный SL машины в P. тропической интегрироваться в генов-мишеней. Последние исследования в P. тропической есть на самом деле указывает на наличие 5 «ведущих сращивания последовательностей ^21. Это исследование подробно методы, которые привели к открытию человека паразит микроРНК-мРНК синтеза транскриптов, в том числе и транскриптомных и translaметоды регулирования ные. Общие цели этих методов, чтобы исследовать влияние малых РНК в регуляции генов, фенотипы и перевода потенциала P. Falciparum стенограммы.

Начальная идентификация химерных транскриптов человека паразит полагаться использования методов анализа РНК, таких как ПЦР в реальном времени, транскриптома последовательности и EST захвата библиотеки, в которую вошли как общая и малые РНК, а не с помощью методов, которые только изолированные малые РНК. Разделительный все РНК в одном большом бассейне, а не по отдельности, позволило идентифицировать как перемещаются человека малых РНК в паразита, а также наличие этих небольших последовательностей РНК, как часть более крупной последовательности. Это то требуется анализ перевода состояния этих мРНК синтеза для определения функциональных последствий этих слияний.

В то время как активные усилия по характеристике генома А.Н. паразитад транскриптомный добавили к пониманию биологии паразита ^22-25, намного меньше известно о трансляционной регуляции транскриптома мРНК через жизненного цикла P. тропической ^26. Это ограниченное понимание протеома паразита препятствовало и понимание биологии паразита и способность идентифицировать новые цели для следующего поколения противомалярийных терапии. Этот разрыв в понимании клеточной биологии паразита сохраняется в значительной степени из-за отсутствия адекватных методов для исследования трансляционной регулирование в P. тропической. Одним из последних бумаги описано применение рибосомальной футпринтинга Р. тропической определить глобальный статус ²¹ перевода. Один хорошо известны измерения поступательного потенциала транскриптов количество связанных рибосом, определяемых полисом профилирования. Однако, когда этот метод применяется к P. тропической </ EM>, она не в состоянии восстановить большинство полисом и захватывает преимущественно monosomes. Недавно несколько групп ^27,28 оптимизировали П. Falciparum методы полисом лизированием эритроцитов и паразитов одновременно сохранить полисом и рибосом характеризуют размещение и поступательное потенциал этих малярийных паразитов во время их бесполого развития в принимающих эритроцитов ^28.

В совокупности, эти методы показывают, что наблюдаемый слияние человека микроРНК и мРНК паразитов модулирует перевод паразит белка слияния этих мРНК, которая была продемонстрирована с использованием сообщалось ранее методы ^27, и является основным фактором, определяющим сопротивление малярии в Hbas и ССРХ эритроцитов ^17. Эти методы будут полезны в любой системе, глядя на выявление и функционально исследовать РНК сплайсинга события, являются ли эти РНК слитые в пределах P. тропической или другие эукариотические системы.

Protocol

1: Выделение малого размера РНК из P. В тропической IDC Получить малярийных паразитов в бесполого культуры 29. ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый размер культура будет варьироваться в зависимости от желаемого применения; Однако культура 10 мл при 3-5% паразитемии и 5% гематокрита …

Representative Results

Глобальный профилирование человека микроРНК в P. тропической Методы, представленные здесь, были использованы для извлечения микроРНК от паразитов в различных условиях. Одна вещь, чтобы отметить, что РНК извлечения для неинфицированных эритроцитов проводили, как у?…

Discussion

HbS является одним из наиболее распространенных вариантов гемоглобина в эндемичных районах малярия, главным образом потому, что обеспечивает защиту от тяжелой малярии, вызванной P. тропической. Методы, необходимые, чтобы охарактеризовать роль человека микроРНК в регуляции ге?…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)