Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Summary

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Abstract

Le dysfonctionnement des mitochondries des muscles squelettiques jouent un rôle dans le métabolisme est modifié observée avec le vieillissement, l'obésité et le diabète de type II. Des dosages de préparations mitochondriales respirométriques mitochondries isolées permettent l'évaluation de la fonction mitochondriale, ainsi que la détermination du mécanisme (s) d'action des médicaments et des protéines qui modulent le métabolisme. Procédures d'isolement actuelles exigent souvent de grandes quantités de tissu pour donner mitochondries de haute qualité nécessaires pour les essais respirométriques. Les méthodes présentées ici décrivent comment haute qualité mitochondries purifiées (~ 450 ug) peut être isolé à partir de quantités minimes (~ 75-100 mg) de muscle squelettique de souris pour une utilisation dans des mesures respiratoires à haut débit. Nous avons déterminé que notre méthode d'isolement donne 92,5 ± 2,0% mitochondries intactes en mesurant l'activité de la citrate synthase spectrophotométrie. En outre, l'analyse Western blot dans les mitochondries isolées abouti à l'expression faibles de l'cytosoprotéines lic, GAPDH, et l'expression robuste de la protéine mitochondriale, COXIV. L'absence d'une bande de GAPDH de premier plan dans les mitochondries isolées est indicatif de la contamination à partir de sources peu de non-mitochondriales au cours de la procédure d'isolement. Plus important encore, la mesure de O ₂ le taux de consommation sur la base d'une technologie de micro-plaque et la détermination du rapport de contrôle respiratoire (RCR) pour des essais couplés respirométriques montre très couplés (RCR;> 6 pour tous les essais) et les mitochondries fonctionnelles. En conclusion, l'addition d'une étape de hachage séparé et réduisant de manière significative entraîné par un moteur vitesse d'homogénéisation d'un procédé précédemment rapporté a permis l'isolement de haute qualité et des mitochondries purifiées à partir de petites quantités de muscle squelettique de souris qui en résulte dans les mitochondries fortement couplés qui respirent avec une haute fonction lors de microplaques base des essais de respirometirc.

Introduction

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis^1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes^3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies^3-5.

Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species^6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.

Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well⁸. Therefore, we present a modification of previously published methods⁷ to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O₂ consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research^9,10.

Protocol

Les études animales ont été effectuées en vertu d'un protocole approuvé par le Institutional Animal Care et utilisent Comité à Virginia Polytechnic Institute et State University. 1. Configuration (Durée: ~ 45 min) Décongeler les magasins de 0,25% de trypsine, Isolation tampon pour mitochondries (IBM) 1 et IBM2 dans un bain d'eau à 37 ° C. Rincer la verrerie et instruments de dissection éthanol à 70% puis à l'eau de haute pureté. Prép…

Representative Results

Activité de la citrate synthase sert de mesure pour l'intégrité de la membrane depuis la citrate synthase est situé dans la membrane mitochondriale interne, et par conséquent ne devrait pas être présent dans les suspensions de mitochondries avec des membranes intactes. La figure 1 représente l'activité de la citrate synthase dans des échantillons non soumis à une sonication mitochondriales par rapport à soniqué des échantillons provenant de la même isolation. Soni…

Discussion

Les méthodes présentées ici fournissent une description détaillée de la procédure d'isolement des mitochondries à partir de quantités minimes (~ 75 à 100 mg) de muscle squelettique de souris. Cette procédure d'isolement est capable de produire de haute fonctionnement, les mitochondries pur (~ 450 ug) comme en témoigne O ₂ taux de consommation, les valeurs RCR, l'activité de la citrate synthase maximale et l'expression de protéines à partir immunoblotting. Fait important, les mito…

Materials

Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched	Sigma Aldrich	238651	N/A
Single Edge Razor Blades	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5mL microcentrifuge tubes with screw cap	Thermo Scientific	3474	N/A
Zirconium Oxide beads	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH antibody (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anti- COXIV antibody	Cell Signaling	4844s	Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	N/A
Pyruvic Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Store at 4°C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20°C
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20°C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Store at 2-8°C
phenylhydrazone
≥98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20°C
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Store at -20°C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Store at room temperature