Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Summary

Ici, nous présentons une modification d’une méthode précédemment rapportée qui permet d’isoler des mitochondries purifiées de haute qualité à partir de plus petites quantités de muscle squelettique de souris. Cette procédure aboutit à des mitochondries fortement couplées qui respirent avec une fonction élevée lors des tests respiratoires sur microplaques.

Abstract

Le dysfonctionnement des mitochondries des muscles squelettiques jouent un rôle dans le métabolisme est modifié observée avec le vieillissement, l'obésité et le diabète de type II. Des dosages de préparations mitochondriales respirométriques mitochondries isolées permettent l'évaluation de la fonction mitochondriale, ainsi que la détermination du mécanisme (s) d'action des médicaments et des protéines qui modulent le métabolisme. Procédures d'isolement actuelles exigent souvent de grandes quantités de tissu pour donner mitochondries de haute qualité nécessaires pour les essais respirométriques. Les méthodes présentées ici décrivent comment haute qualité mitochondries purifiées (~ 450 ug) peut être isolé à partir de quantités minimes (~ 75-100 mg) de muscle squelettique de souris pour une utilisation dans des mesures respiratoires à haut débit. Nous avons déterminé que notre méthode d'isolement donne 92,5 ± 2,0% mitochondries intactes en mesurant l'activité de la citrate synthase spectrophotométrie. En outre, l'analyse Western blot dans les mitochondries isolées abouti à l'expression faibles de l'cytosoprotéines lic, GAPDH, et l'expression robuste de la protéine mitochondriale, COXIV. L'absence d'une bande de GAPDH de premier plan dans les mitochondries isolées est indicatif de la contamination à partir de sources peu de non-mitochondriales au cours de la procédure d'isolement. Plus important encore, la mesure de O ₂ le taux de consommation sur la base d'une technologie de micro-plaque et la détermination du rapport de contrôle respiratoire (RCR) pour des essais couplés respirométriques montre très couplés (RCR;> 6 pour tous les essais) et les mitochondries fonctionnelles. En conclusion, l'addition d'une étape de hachage séparé et réduisant de manière significative entraîné par un moteur vitesse d'homogénéisation d'un procédé précédemment rapporté a permis l'isolement de haute qualité et des mitochondries purifiées à partir de petites quantités de muscle squelettique de souris qui en résulte dans les mitochondries fortement couplés qui respirent avec une haute fonction lors de microplaques base des essais de respirometirc.

Introduction

La fonction principale des mitochondries est de produire de l’ATP à partir de la phosphorylation oxydative. Cependant, les mitochondries ont de nombreuses autres fonctions cellulaires importantes, y compris, mais sans s’y limiter : la production et la détoxification des espèces réactives de l’oxygène, la régulation du calcium cytoplasmique et mitochondrial, le trafic d’organites, l’homéostasie ionique et l’implication dans l’apoptose^1,2. Par conséquent, il n’est pas surprenant que les mitochondries dysfonctionnelles jouent un rôle dans de nombreuses pathologies pathologiques, telles que le vieillissement, les maladies neurodégénératives, les maladies cardio....

Protocol

Les études animales ont été effectuées en vertu d'un protocole approuvé par le Institutional Animal Care et utilisent Comité à Virginia Polytechnic Institute et State University.

1. Configuration (Durée: ~ 45 min)

1. Décongeler les magasins de 0,25% de trypsine, Isolation tampon pour mitochondries (IBM) 1 et IBM2 dans un bain d'eau à 37 ° C.
2. Rincer la verrerie et instruments de dissection éthanol à 70% puis à l'eau de haute pureté.
3. Préparer la solution de trypsine à 0,05% de 0,25% de trypsine de stock en diluant 1 partie trypsine en 4 parties IBM1.
4. Mélanger la protéase et inhibiteur de pho....

Results

Activité de la citrate synthase sert de mesure pour l'intégrité de la membrane depuis la citrate synthase est situé dans la membrane mitochondriale interne, et par conséquent ne devrait pas être présent dans les suspensions de mitochondries avec des membranes intactes. La figure 1 représente l'activité de la citrate synthase dans des échantillons non soumis à une sonication mitochondriales par rapport à soniqué des échantillons provenant de la même isolation. Soniquant les résultats de .......

Discussion

Les méthodes présentées ici fournissent une description détaillée de la procédure d'isolement des mitochondries à partir de quantités minimes (~ 75 à 100 mg) de muscle squelettique de souris. Cette procédure d'isolement est capable de produire de haute fonctionnement, les mitochondries pur (~ 450 ug) comme en témoigne O ₂ taux de consommation, les valeurs RCR, l'activité de la citrate synthase maximale et l'expression de protéines à partir immunoblotting. Fait important, les mitochondries isol.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essentiellement gras	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Sans acide - BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/D
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Saccharose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Chlorure de sodium cristaux blancs ou poudre cristalline &ge ; 99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Dodécylsulfate de sodium	Sigma Aldrich	L3771  ;	n/a
Désoxycholate de sodium	Sigma Aldrich	D6750  ;	n/a
Polyoxyéthylène (12) nonylphényléther ramifié	Sigma Aldrich	238651	N/A
Lames de rasoir à un seul tranchant	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Crépines à cellules en nylon	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protéase & Cocktail inhibiteur de phosphatse Thermo	Scientific	1861284	N/A
Tubes microcentrifuges de 1,5 ml avec bouchon à vis	Thermo Scientific	3474	N/A
Billes d’oxyde de zirconium	Fisher Scientific	C9012112	S.O
. Anticorps GAPDH (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anticorps anti-COXIV	Signalisation cellulaire	4844s	N’importe quelle protéine de la membrane interne mitochondriale suffira
Peroxydase conjuguée affinipure Âne, Anti Lapin IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxydase conjuguée affinipure Chèvre, Anti Souris IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Kit de dosage des protéines  ;	Thermo Scientific	23225	N/A
Acide pyruvique, 98 %	Sigma Aldrich	107360	Magasin à 4 ° ; C, pH à 7,4 avec KOH avant utilisation dans un test respiratoire
Acide succinique	Sigma Aldrich	S9512	Conserver à température ambiante, pH à 7,4 avec KOH avant d’être utilisé dans un test respiratoire
L(-) Acide malique, BioXtra, &ge ; 95 %	Sigma Aldrich	M6413	Conserver à température ambiante, à 7,4 avec KOH avant utilisation dans un test respiratoire
Acide L-glutamique	Sigma Aldrich	G1251	Conserver à température ambiante, à 7,4 avec KOH avant d’être utilisé dans un test respirométrique, à 7,4 avec KOH avant d’être utilisé dans un test respiratoire Palmitoyl
L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Conserver à -20 ° ;C
Oligomycine A, &ge ; 95 % (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Stocker à -20 ° ; C
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Stocker à 2-8 ° ; C
phénylhydrazone
&ge ; 98 % (TLC), poudre [FCCP]
Antimycine A de streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Magasin à -20 ° ; C
Adénosine 5&prime ;-diphosphate monopotassique déshydraté [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Conserver à -20 ° ; C, à 7,4 avec KOH avant utilisation dans le dosage
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Conserver à température ambiante