Colonic स्टेम सेल म्यूटेशन की मात्रा
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
स्टेम सेल म्यूटेशन उपाय करने की क्षमता, एक रासायनिक संभावित कैंसर को जन्म दे कि म्यूटेशन के लिए प्रेरित कर सकते हैं, और किस हद तक एक महत्वपूर्ण सेल की आबादी में यों के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। एक्स से जुड़े ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज जीन में स्टेम सेल म्यूटेशन यों के लिए एक एंजाइमी परख का उपयोग पहले से सूचित किया गया है। एक यह तरीका एक है कि पैदावार एक प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ sectioned ऊतक के जमे हुए वर्गों और ऊष्मायन की तैयारी की आवश्यकता है कोशिकाओं कार्यात्मक ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (G6PD) एंजाइम का उत्पादन करता है, तो नीला रंग। यदि नहीं, तो कोशिकाओं श्वेताभ दिखाई देते हैं। हम polyvinyl शराब की जगह में इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर) माध्यम का उपयोग कर प्रतिक्रिया मिश्रण को संशोधित किया है। यह, पीएच माप की सुविधा G6PD धुंधला घटकों के solubilization बढ़ जाती है और G6PD एंजाइम का प्रसार प्रतिबंधित करता है। एक उत्परिवर्तन एक स्टेम सेल में होने वाले प्रदर्शन करने के लिए, पूरे तहखाना G6PD एंजाइमी की कमी चाहिएगतिविधि। एक स्टेम सेल बंदरगाहों तभी एक प्ररूपी G6PD उत्परिवर्तन कब्रगाह में संतान के सभी G6PD enzymatic गतिविधि की कमी होगी। एक स्टेम सेल उत्परिवर्तन के साथ तहखाने की पहचान करने के लिए, लगातार चार आसन्न जमे हुए वर्गों (एक स्तर) 7 माइक्रोन मोटाई में काट रहे थे। आसन्न कटौती करने का यह दृष्टिकोण एक ही उत्परिवर्तित तहखाना आसन्न वर्गों में मनाया जाएगा के बाद से एक तहखाना पूरी तरह से उत्परिवर्तित था कि रचना प्रदान करता है। 50 से अधिक माइक्रोन अलग थे कि ऊतकों के नमूनों के साथ स्लाइड माउस प्रति> 10 4 तहखाने की कुल आकलन करने के लिए तैयार थे। उत्परिवर्तन आवृत्ति एक इलाज के समूह में जंगली प्रकार (नीला) के तहखाने की संख्या से ÷ मनाया उत्परिवर्तित (सफेद) तहखाने की संख्या है।
Introduction
पेट के कैंसर का डीएनए को नुकसान पहुंचा सकता है कि पर्यावरण एजेंटों और आहार घटकों के लिए जोखिम शामिल है और (जैसे एपीसी) ट्यूमर शमन जीन में म्यूटेशन ओंकोजीन में दैहिक म्यूटेशन को सक्रिय करने के लिए (जैसे, एसएस catenin) या निष्क्रिय उत्पादन करने के लिए सोचा है। यह इन महत्वपूर्ण म्यूटेशन colonic स्टेम कोशिकाओं में पाए जाते हैं कि माना जाता है। क्योंकि colonic उपकला की अनूठी तहखाना वास्तुकला की, यह पेट के कैंसरजनन के साथ जुड़े रसायनों के लिए जानवरों को प्रकाश में लाने के बाद पेट में स्टेम सेल म्यूटेशन को मापने के लिए संभव है। म्यूटेशन एक तहखाना के भीतर सभी कोशिकाओं में उपस्थित रहेंगे रूप में कई एक्स से जुड़े एंजाइमों, स्टेम कोशिकाओं में पाए जाते हैं कि परिवर्तन के लिए संकेतक के रूप में सेवा कर सकते हैं।
इससे पहले, एक प्रक्रिया चूहों में पेट के ट्यूमर को उत्पन्न कि रसायन भी एक्स से जुड़े ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (G6PD) जीन में उत्परिवर्तन के विश्लेषण के माध्यम से पेट में दैहिक स्टेम सेल म्यूटेशन उत्पन्न प्रदर्शन है कि प्रकाशित किया गया था। 1-3विधि किसी भी चयन दबाव के बिना colonic स्टेम कोशिकाओं में यादृच्छिक दैहिक म्यूटेशन की घटनाओं quantifies। प्रक्रिया का इलाज किया और नियंत्रण चूहों से unfixed जमे हुए पेट के वर्गों के उत्पादन और कार्यात्मक G6PD गतिविधि का उत्पादन है कि कोशिकाओं से रहित तहखाने की पहचान शामिल है। सफेद दिखाई देते हैं जो इन उत्परिवर्तित तहखाने, उत्परिवर्तन भी एक उत्परिवर्तित G6PD जीन को शरण देने संतान को जन्म दे दिया है कि एक स्टेम सेल में होने वाले संकेत मिलता है। एंजाइमी परख में, G6PD कमी उत्परिवर्ती तहखाने नाइट्रो नीले tetrazolium (एनबीटी) की कमी के लिए आवश्यक है, जो ग्लूकोज-6-फॉस्फेट, oxidize नहीं कर सकते। G6PD एंजाइम कार्यात्मक हो गया है, धुंधला मिश्रण में एनबीटी एंजाइम और नीले "धुंधला" कोशिकाओं के स्थान पर जमते, अघुलनशील formazan और अवक्षेप के लिए कम है। G6PD म्यूटेंट हैं कि कोशिकाओं नीले दाग जंगली प्रकार तहखाने के विपरीत श्वेताभ रहते हैं। इस पद्धति का एक "शून्य" phenotype है कि म्यूटेशन के उपाय। एन क्योंकिzymes, ऐसे G6PD के रूप में, वर्गों एक जलीय घोल में रखा जाता है, तो एक unfixed ऊतक खंड पर कोशिकाओं के बाहर फैलाना कर सकते हैं, यह विश्लेषण करने की ऊतक वर्गों में एंजाइम को स्थिर करने के लिए आवश्यक है। 4 में एंजाइम का स्थिरीकरण ऊतक G6PD enzymatic प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक छोटे अभिकर्मक अणुओं के प्रसार के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए।
हम मूल प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तन के एक नंबर दिया गया है। महत्वपूर्ण एंजाइमी धुंधला के लिए मध्यम पीएच नियंत्रण और परख में इस्तेमाल किया घटकों के solubilization सुविधा है, जो इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर), के लिए polyvinyl शराब से बदल दिया गया है। प्रत्येक ऊतक अनुभाग G6PD प्रतिक्रिया मिश्रण का एक ही मात्रा प्राप्त इतना है कि स्टील वाशर का बना 0.5 मिलीलीटर कुओं – धुंधला 0.4 का उपयोग किया जाता है। एक प्रक्रिया के लिए बिना colonic ऊतक का एक बड़ा नमूना प्रदान करता है कि एक imaged अनुभाग में तहखाने की संख्या का अनुमान करने के लिए विकसित किया गया था,मैन्युअल> प्रत्येक पेट के लिए 10 5 तहखाने गिनती करने के लिए। आसन्न 7 माइक्रोन ऊतक वर्गों का विश्लेषण संभावित धुंधला कलाकृतियों को कम कर देता है, जो एक से अधिक स्लाइड, पर एक उत्परिवर्ती तहखाना के दृश्य देता है। ये परिवर्तन प्रक्रिया को और अधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाते हैं।
इस संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम, मूषक में एक प्रसिद्ध पेट के कैसरजन azoxymethane को C57BL / 6 चूहों के प्रदर्शन के बाद colonic स्टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्तन आवृत्ति मात्रा निर्धारित किया है। 5-7
Protocol
Representative Results
Discussion
अक्सर एक यौगिक के जेनोटोक्सिक प्रभाव डीएनए को संशोधित करने के लिए अपनी क्षमता से निर्धारित होता है। यह सामान्य रूप से ऊतक को अलग-थलग करने और डीएनए adducts की वैश्विक स्तर मापने के द्वारा किया जाता है। AOM के ल…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों कोई स्वीकृतियां है।
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
