La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
La capacidad de medir las mutaciones de células madre es una poderosa herramienta para cuantificar en una población celular crítico si, y en qué medida, un producto químico puede inducir mutaciones que potencialmente conducen al cáncer. El uso de un ensayo enzimático para cuantificar mutaciones de células madre en el gen de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X se ha informado anteriormente. 1 Este método requiere la preparación de secciones congeladas y la incubación del tejido seccionado con una mezcla de reacción que produce una el color azul si las células producen la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) enzima funcional. Si no, las células aparecen de color blanquecino. Hemos modificado la mezcla de reacción usando Compuesto de corte óptimo de temperatura (OCT) medio en lugar de alcohol de polivinilo. Esto facilita la medición del pH, aumenta la solubilización de los componentes de tinción de G6PD y restringe la difusión de la enzima G6PD. Para demostrar que se produjo una mutación en una célula madre, toda la cripta debe carecer de G6PD enzimáticaactividad. Sólo si una célula madre alberga una mutación G6PD fenotípica será toda la progenie en la cripta carecen de actividad enzimática de G6PD. Para identificar las criptas con una mutación de células madre, cuatro secciones congeladas adyacentes consecutivos (un nivel) se redujeron a 7 micras espesores. Este enfoque de hacer cortes adyacentes ofrece conformación que una cripta estaba completamente mutado ya se observó la misma cripta mutado en las secciones adyacentes. Diapositivas con muestras de tejidos que fueron más de 50 micras, aparte estaban preparados para evaluar un total de> 10 4 criptas por ratón. La frecuencia de mutación es el número de mutados (blanco) ÷ criptas observados por el número de tipo salvaje (azul) criptas en un grupo de tratamiento.
Introduction
Se cree que el cáncer de colon de involucrar a la exposición a los agentes ambientales y componentes de la dieta que pueden dañar el ADN y producir la activación de mutaciones somáticas en oncogenes (por ejemplo, ß-catenina) o inactivación de las mutaciones en los genes supresores de tumores (por ejemplo, APC). Se supone que estas mutaciones se producen críticos en las células madre del colon. Debido a la arquitectura única de la cripta epitelio del colon, es posible medir las mutaciones de células madre en el colon después de exponer a los animales a los productos químicos asociados con la carcinogénesis de colon. Varias enzimas ligadas al cromosoma X pueden servir como indicadores para las mutaciones que se producen en las células madre, ya que las mutaciones estarán presentes en todas las células dentro de una cripta.
Anteriormente, un procedimiento se publicó que demuestra que los productos químicos que inducen tumores de colon en ratones también generaron mutaciones de células madre somáticas en el colon a través de análisis de mutaciones en el nivel de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X gen (G6PD) 1-3.El método cuantifica la incidencia de mutaciones somáticas aleatorias en las células madre del colon sin ninguna presión de selección. El procedimiento implica la producción de secciones de colon no fijadas congelados procedentes de ratones tratados y de control y la identificación de criptas desprovistas de células que producen la actividad G6PD funcional. Estas criptas mutados, que aparecen blanco, indican que la mutación se produjo en una célula madre que dio origen a la progenie también alberga un gen G6PD mutado. En el ensayo enzimático, criptas G6PD mutante deficiente no pueden oxidar la glucosa-6-fosfato, que se requiere para la reducción de nitro azul tetrazolio (NBT). Cuando la enzima G6PD es funcional, el NBT en la mezcla de tinción se reduce a formazán insoluble y precipita, acumulando en la ubicación de la enzima y células "de tinción" azules. Las células que son mutantes de G6PD permanecen blanquecino en contraste con azul manchadas criptas de tipo salvaje. Este método mide mutaciones que tienen un fenotipo "nulo". Debido a que enenzimas, tales como G6PD, puede difundirse fuera de las células en una sección de tejido no fijado si las secciones se colocan en una solución acuosa, es necesario para estabilizar la enzima en las secciones de tejido a analizar. 4 La estabilización de la enzima en el tejido no debe interferir con la difusión de pequeñas moléculas de reactivo necesario para la reacción enzimática G6PD.
Hemos hecho una serie de cambios significativos en el procedimiento original. El medio para la tinción enzimática crítica ha sido cambiado de alcohol de polivinilo a Optimal Compuesto Temperatura de corte (OCT), lo que facilita el control del pH y la solubilización de los componentes utilizados en el ensayo. La tinción se realiza usando 0,4 – 0,5 ml pozos hechos de arandelas de acero de manera que cada sección de tejido recibió el mismo volumen de la mezcla de reacción G6PD. Se desarrolló un procedimiento para estimar el número de criptas en una sección fotografiado que proporciona una gran toma de muestras del tejido del colon sin tenerpara contar manualmente> 10 5 criptas para cada colon. El análisis de los adyacentes 7 micras secciones de tejido permite la visualización de una cripta mutante en más de una diapositiva, lo que reduce los posibles artefactos de tinción. Estos cambios hacen que el procedimiento sea más eficiente y reproducible.
El uso de este protocolo revisado, hemos cuantificado la frecuencia de mutación en las células madre del colon después de la exposición de ratones C57BL / 6 a azoximetano, un carcinógeno bien conocido de colon en roedores 5-7.
Protocol
Representative Results
Discussion
A menudo, el efecto genotóxico de un compuesto se determina por su capacidad de modificar el ADN. Esto se hace normalmente aislando el tejido y midiendo el nivel global de aductos de ADN. Para AOM, esto implicaría la cuantificación O 6 metilguanina aductos en el colon. Con esta información el enfoque sobre los daños dentro de los tipos de células específicas, como en el nicho de células madre, se pierde. Además, un aducto de ADN no es lo mismo que una mutación ya que sólo un pequeño subconjunto de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
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