De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires
Summary
β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Abstract
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
Introduction
β-baril OMP ne peuvent être trouvés dans la membrane externe des mitochondries, des chloroplastes, et des bactéries Gram-négatives 1-3. Bien qu'elles remplissent des fonctions similaires comme les protéines alpha-hélicoïdale, ils ont un pli très différent consistant en un domaine β-baril membrane-embedded centrale allant de 8-26 brins ß antiparallèles avec chaque brin étant relié intimement aux deux brins voisins (figures 1 et 2). Les premiers et derniers brins du domaine β-baril puis interagissent les uns avec les autres, presque exclusivement d'une manière anti-parallèle (à l'exception des VDAC mitochondrial), pour fermer et sceller le domaine β-canon de la membrane entourant. Tous les OMP β-baril ont des boucles extracellulaires de faire varier la séquence et la longueur, qui jouent un rôle important dans les interactions ligand et / ou des contacts protéine-protéine, avec ces boucles étant parfois aussi grande que 75 résidus, tels que trouvés dans la liaison de Neisseria transferrine proUne protéine (TbpA) 4. β-baril OMP peuvent également avoir des extensions périplasmiques N-terminales ou C-terminales qui servent de domaines supplémentaire pour but fonctionnel de la protéine (par exemple BamA 5-7, FimD 8,9, FADL 10). Alors que de nombreux types de OMP β-baril existent 11, deux des types les plus courants sont décrits ci – dessous à titre d' exemples pour ceux qui sont moins familiers avec le terrain, (1) transporteurs TonB-dépendants et (2) autotransporters.
Transporteurs TonB-dépendants (par exemple, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) sont essentiels pour l' importation d'éléments nutritifs et contiennent un domaine de prise N-terminal constitué de ~ 150 résidus qui se trouve replié à l' intérieur d' un 22 brin β- C-terminal baril domaine incorporé dans la membrane externe 12 (figure 3). Bien que ce bouchon empêche domaine substrat de passer librement à travers le domaine du canon, la liaison au substrat induit un changement conformationnel dans le domaine du bouchon thà conduit à la formation de pores (soit par prise réarrangement ou partielle complète d'éjection / de la fiche) qui peut alors faciliter le transport du substrat à travers la membrane externe dans le périplasme. Les transporteurs TonB-dépendants sont particulièrement importantes pour la survie de certaines souches pathogènes de bactéries Gram-négatives telles que Neisseria meningitidis qui ont évolué à des transporteurs spécialisés qui détournent des nutriments tels que le fer directement à partir de protéines de l' hôte humain 4,13,14.
Autotransporteurs appartiennent au système de sécrétion de type V de bactéries Gram-négatives et sont OMP tonneau ß qui se composent d'un domaine β-canon (typiquement 12 brins comme avec ESTA et ESPP) et un domaine passager qui est soit sécrétées ou présentés à la surface de la cellule 15,16 (figure 3). Ces OMP β-baril servent souvent un rôle important dans la survie des cellules et la virulence avec le domaine passager servant soit comme une protéase, une adhésine, et / ou d'autres effecteur qui médie la pathogenèse.
méthodes structurelles telles que la cristallographie aux rayons X, spectroscopie RMN, et la microscopie électronique (EM) nous permettent de déterminer des modèles pour les OMP à résolution atomique qui peut à son tour être utilisés pour déchiffrer exactement comment ils fonctionnent dans la membrane externe. Cette information précieuse peut alors être utilisé pour le développement de vaccins et de médicaments le cas échéant. Par exemple, la liaison de la transferrine protéine A (TbpA) se trouve sur la surface de Neisseria et est nécessaire pour la pathogenèse , car il se lie directement la transferrine humaine, puis extrait et importe le fer pour sa propre survie. Sans TbpA, Neisseria ne peut pas récupérer le fer de l'hôte humain et sont rendus non pathogènes. Après que la structure cristalline de la transferrine humaine lié à TbpA 4 a été résolu, il est devenu beaucoup plus clair comment les deux protéines associées, quelles régions de TbpA médiés l'interaction, ce que les résidus étaient importants pour l' extraction de fer par TbpA etcomment on peut développer des thérapeutiques contre Neisseria ciblant TbpA. Par conséquent, étant donné l'importance des OMP β-baril dans les bactéries Gram-négatives pour la survie et la pathogenèse, ainsi que dans les mitochondries et la fonction chloroplaste, et la nécessité d'informations structurelles supplémentaires sur cette classe unique de protéines membranaires et les systèmes dans lesquels ils fonctionnent , les protocoles généraux sont présentés dans le but général d'exprimer et de purifier les OMP cibles à des niveaux élevés pour la caractérisation par des méthodes structurelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
β-baril OMP jouent des rôles essentiels dans les bactéries Gram-négatives, les mitochondries et les chloroplastes et sont des cibles importantes pour l'analyse structurelle qui offrent une multitude d'informations sur les mécanismes moléculaires essentiels aux membranes extérieures de ces organites respectives. Cependant, la production d'échantillon suffisant pour l'analyse structurelle est pas toujours simple et, par conséquent, un pipeline général est présenté pour la production de quantit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Materials
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
| SS34 rotor | Sorvall | – | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | – | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
| Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |
References
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