Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine di membrana
Summary
β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Abstract
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
Introduction
β-barile OMP si possono trovare solo nelle membrane esterne di mitocondri, cloroplasti, e batteri Gram-negativi 1-3. Mentre servono ruoli simili come proteine alfa-elica, hanno una piega molto diversa costituito da un dominio β-barrel membrana incorporato centrale vanno da 8-26 anti-paralleli beta trefoli con ciascun trefolo essendo intimamente collegato ai due fili adiacenti (figure 1 e 2). Il primo e l'ultimo fili di dominio β-barile poi interagiscono tra loro, quasi esclusivamente in modo antiparallelo (eccetto VDAC mitocondriale), per chiudere e sigillare il dominio β-barile dalla membrana circostante. Tutti OMP β-barile hanno loop extracellulari di diversa sequenza e lunghezza che svolgono un ruolo importante nelle interazioni ligando e / o contatti proteina-proteina, con questi loop talvolta essere grande come 75 residui, come trovato in Neisserial transferrina vincolante proTEIN A (TBPA) 4. β-barile OMP possono avere anche le estensioni periplasmatiche N-terminale o C-terminale che servono domini come ulteriori per scopo funzionale della proteina (ad esempio, Bama 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Mentre esistono molti tipi di OMP β-botte 11, due dei tipi più comuni sono descritti di seguito come esempi per quelli meno familiarità con il campo, (1) trasportatori TonB-dipendente e (2) automezzi.
Trasportatori TonB-dipendenti (ad esempio, FEPA, TBPA, BTub, Cir, etc.) sono essenziali per l'importazione di nutrienti e contengono un dominio spina N-terminale costituito da ~ 150 residui che si trova nascosto all'interno di un C-terminale di 22-bloccati β- dominio barilotto incorporato nella membrana esterna 12 (figura 3). Anche se questo dominio spina impedisce supporto a partire da liberamente passando per il dominio barile, legame del substrato induce un cambiamento conformazionale all'interno del dominio spina °in porta a poro formazione (sia per spina riarrangiamento o parziale / totale espulsione del tappo), che possono poi facilitare il trasporto del substrato attraverso la membrana esterna in periplasma. Trasportatori TonB-dipendenti sono particolarmente importanti per la sopravvivenza di alcuni ceppi patogeni di batteri Gram-negativi, come Neisseria meningitidis che si sono evoluti trasportatori specializzati che si impadroniscono nutrienti come il ferro direttamente da proteine ospite umani 4,13,14.
Automezzi appartengono al tipo di sistema di secrezione V di batteri Gram-negativi e sono OMP beta-barile che consistono di un dominio β-barile (tipicamente 12-fili, come con ESTA e ESPP) e un dominio del passeggero che è o secreti o presentati al superficie della cellula 15,16 (figura 3). Questi OMP β-barile servono spesso ruoli importanti nella sopravvivenza cellulare e virulenza con il dominio passeggero che serve sia come proteasi, adhesin, e / o altri effector che media patogenesi.
metodi strutturali come la cristallografia a raggi X, la spettroscopia NMR, e la microscopia elettronica (EM) ci permettono di determinare modelli per le OMP a risoluzione atomica, che può a sua volta essere utilizzati per decifrare esattamente come funzionano all'interno della membrana esterna. Queste informazioni preziose può quindi essere utilizzato per lo sviluppo di farmaci e vaccini, se applicabile. Per esempio, il legame transferrina proteina A (TBPA) si trova sulla superficie del Neisseria ed è necessario per la patogenesi perché si lega direttamente transferrina umana e poi estrae ed importa il ferro per la propria sopravvivenza. Senza TBPA, Neisseria non può pulire il ferro da ospite umano e sono resi non patogeni. Dopo che la struttura cristallina della transferrina umana legato al TBPA 4 è stato risolto, è diventato molto più chiaro come le due proteine associate, quali regioni della TBPA mediata interazione, ciò residui erano importanti per l'estrazione ferro TBPA, ecome si potrebbe sviluppare terapie contro Neisseria di targeting TBPA. Pertanto, data l'importanza di OMP β-barile nei batteri Gram-negativi per la sopravvivenza e la patogenesi, nonché nei mitocondri e funzione cloroplasti, e la necessità di informazioni strutturali aggiuntive su questa classe unica di proteine di membrana e sistemi in cui funzionano , protocolli generali vengono presentati con l'obiettivo generale di esprimere e purificare OMP bersaglio ad alti livelli per la caratterizzazione con metodi strutturali.
Protocol
Representative Results
Discussion
β-barile OMP servono ruoli essenziali nel batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti e sono obiettivi importanti per l'analisi strutturale che offrono una ricchezza di informazioni sui meccanismi molecolari essenziali a membrane esterne di queste rispettive organelli. Tuttavia, producendo abbastanza campione per l'analisi strutturale non è sempre agevole e, pertanto, una condotta generale è presentato per la produzione di quantità sufficienti di bersaglio OMP β-barile per la determinazione della strutt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Materials
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
| SS34 rotor | Sorvall | – | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | – | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
| Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |
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