β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에
Summary
β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Abstract
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
Introduction
β-배럴 OMPs은 미토콘드리아, 엽록체의 외부 세포막에서 발견, 및 그람 음성 박테리아 1-3 될 수있다. 그들은 α 나선 단백질와 유사한 역할을 제공하지만, 이들은 각 가닥은 속속들이 이웃하는 두 가닥에 연결되면서 8-26 역 평행 β 가닥 범위의 중앙 막 매립 β 배럴 도메인으로 구성된 매우 다른 스크롤을 (도 1 및도 2). β 배럴 영역의 처음과 마지막 스트랜드는 닫고 주위 막에서 β 배럴 영역을 밀봉한다 (미토콘드리아 VDAC 제외)를 역 평행 형태로 거의 독점적으로 서로 상호 작용한다. 모든 β 배럴 OMPs 이러한 루프 때때로 Neisserial의 트랜스페린 검색된 프로 바인딩 75 잔기로 대형 인 상태 리간드의 상호 작용 및 / 또는 단백질 – 단백질 연락처에 중요한 역할을하는 다양한 서열 및 길이의 세포 외 루프가TEIN A (TbpA) 4. β-배럴 OMPs 또한 단백질의 기능적인 목적으로 도메인을 추가로 제공 N- 말단 또는 C- 말단 주변 세포질 확장 할 수 있습니다 (예를 들어, 아저씨 5-7, FadL (10) 8,9, FimD). β-배럴 OMPs 많은 종류의 11 존재하지만,보다 일반적인 유형의 두 분야 (1) TonB 종속 운송 (2) autotransporters 덜 익숙한 사람들을 위해 예로서 아래에 설명되어 있습니다.
TonB 종속 전송기 (예를 들면, FEPA, TbpA, BtuB, CIR, 등) 영양 오기 필수적이며, A는 C 말단 β- 22 가닥 안에 꿰매 발견 ~ 150 개의 잔기로 구성된 N – 말단 플러그 도메인을 포함 배럴 도메인 외막 (12) (도 3)에 매립. 이 플러그 도메인 자유롭게 배럴 영역을 통과 기질을 방지하는 동안, 기판은 결합 플러그 내의 도메인 번째 형태 변화를 유도리드에서 (플러그 재 배열하거나 플러그의 부분 / 전체 배출에 의해 하나)를 페리 플라 즘으로 외부 막에 걸쳐 기판 운반을 용이하게 할 수있다 형성 기공합니다. TonB 종속 전송기는 이러한 인간 숙주 단백질 4,13,14에서 직접 철 같은 영양소를 납치 전문 운송을 진화 나이 세리아 뇌수막염으로 그람 음성 박테리아의 일부 병원성 균주의 생존에 특히 중요하다.
Autotransporters는에서 분비 또는 제시 중 하나 β-배럴 도메인 (ESTA와 ESPP와 같이 일반적으로 12 가닥)으로 구성 β-배럴 OMPs와 승객 도메인을 그람 음성 세균의 type V 분비 시스템에 속하고 있습니다 셀 (15, 16) (그림 3)의 표면. 이 β-배럴 OMPs는 종종 역할을하는 승객 도메인과 세포 생존 및 독성에 중요한 역할을 역할 중 하나 프로테아제, 어드, 및 / 또는 기타 EF 등fector 그 발병 기전을 매개.
이러한 X 선 결정학, NMR 분광법, 및 전자 현미경 (EM) 우리 차례가 외막에서 작동 정확히 해독하는데 사용할 수있는 원 해상도의 OMPs위한 모델을 결정하도록 허용하는 구성 방법. 이것은 귀중한 정보는 해당되는 경우 약물 및 백신 개발을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 트랜스페린 결합 단백질 A (TbpA)은 나이 세리아의 표면 상에 발견하고 직접 인간 트랜스페린 결합하고 추출 자체 생존 철 수입 때문에 발병 요구된다. TbpA없이, 나이 세리아 인간 호스트로부터 철을 청소할 수 없으며 비병원성 렌더링된다. TbpA 4에 결합 인간 트랜스페린의 결정 구조를 해결 한 후, 두 단백질이 관련된 얼마나 명확하게되었다 TbpA 어떤 영역의 상호 작용을 매개, TbpA 의해 철 추출 중요한 있었는지 잔기 및어떻게 하나 TbpA을 대상으로 나이 세리아에 대한 치료제를 개발하고 있습니다. 따라서, 생존 병인 그람 음성균에 β 배럴 OMPs의 중요성을 고려할뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 기능 및 추가 구조 막 단백질의 독특한 클래스에 대한 정보가 작동하는 시스템에 대한 필요 일반적으로 프로토콜은 표현 및 구조 방법에 의해 특성화에 대한 높은 수준의 목표 OMPs 정화의 전반적인 목표되게됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
β-배럴 OMPs는 세균, 미토콘드리아와 엽록체 그람 음성에 필수적인 역할을 제공하고 이러한 각각의 세포 기관의 외부 막에 필수적인 분자 메커니즘에 대한 풍부한 정보를 제공하는 구조 분석을위한 중요한 표적이다. 그러나, 구조 분석을 위해 충분한 샘플을 제조 항상 간단하지 않으며, 따라서, 일반적인 파이프 상세히의 결정 구조의 처리를 설명하는 구조 결정을위한 타겟 β 배럴 OMPs 충분한 양?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Materials
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
| SS34 rotor | Sorvall | – | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | – | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
| Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |
References
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