فيفو السابقين المعوية الحويصلات لتقييم الأغشية المخاطية النفاذية في نماذج من الأمراض المعوية
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
الحاجز الظهاري هو أول دفاع الفطرية في الجهاز الهضمي، وينظم بشكل انتقائي النقل من التجويف إلى المقصورات الأنسجة الكامنة، وتقييد نقل جزيئات أصغر عبر الظهارة وتقريبا تحظر تماما نقل الجزيئات الظهارية. يتم تحديد هذه الانتقائية من قبل طبقة جل المخاطية، مما يحد من نقل جزيئات محبة للدهون وكل من مستقبلات قمي والمجمعات البروتين صلي ضيقة من الظهارة. في المختبر نماذج ثقافة خلية من خلايا ظهارة هي مريحة، ولكن كنموذج، فإنها تفتقر إلى تعقيد التفاعلات بين الجراثيم، المخاطية هلام، ظهارة والجهاز المناعي. من ناحية أخرى، يمكن أداؤها في الجسم الحي تقييم امتصاص الأمعاء أو النفاذية، ولكن هذه المقايسات قياس امتصاص الجهاز الهضمي بشكل عام، مع عدم وجود دليل على خصوصية الموقع. فيفو السابقين فحوصات النفاذية باستخدام "الحويصلات المعوية". هي طريقة أسرع وأكثر دقة لقياس إما سلامة المعوية العامة أو وسائل النقل المقارن من جزيء محدد، مع ميزة إضافية تتمثل في الأمعاء الموقع خصوصية. نحن هنا وصف إعداد الحويصلات المعوية للدراسات النفاذية وحساب نفاذية واضحة (P التطبيق) من جزيء عبر الحاجز المعوي. ويمكن استخدام هذه التقنية كوسيلة لتقييم امتصاص الدواء، أو لفحص الخلل حاجز الظهارية الإقليمي في النماذج الحيوانية من الأمراض المعوية.
Introduction
حاجز الظهارية في الأمعاء الجهاز الهضمي هو منطقة سطح الغشاء المخاطي تقدر ب 400 م 2 في الإنسان البالغ. ونتيجة لذلك، يتعرض باستمرار للطعن من الميكروبات، والمخدرات بلعها، المواد الغذائية والسموم البكتيرية. المضيف يجب أن لا يميز فقط بين البكتيريا المتعايشة مقبولة ومسببات الأمراض المحتملة، ولكن يجب منع هذه الأنواع والجزيئات التي يفرزها من عبور حاجز الظهارية، بينما في نفس الوقت مما يتيح امتصاص المواد الغذائية. وهكذا، فإن دور ظهارة الأمعاء هو بمثابة حاجز انتقائي لمحتويات اللمعية 1. ويتحقق ذلك، في جزء منه، من قبل نظام الدفاع الظهارية الفطري في الغشاء المخاطي، الذي يعمل من خلال نظام بيولوجي استجابة تتألف من آليات التأسيسية ومحرض 2.
فقدان وظيفة طلائي الحاجز هو علم الأمراض الذي هو سمة من عدد من أمراض الجهاز الهضمي. وفي الجسم الحييمكن تقدير فحص وظيفة حاجز الظهارية من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم من جزيء التتبع وتحليل مصل الدم لاحق 3. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب لا يقدم أي إشارة إلى موقع الخلل الحاجز. في المختبر، وبحكم فيفو تقييم المقاومة بطريق الظهارة باستخدام أنظمة Transwell 3 و غرفة أوسينج 4،5 على التوالي، يعملون عادة كعلامات بديلة من وظيفة حاجز الظهارية، ولكنها تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء الأمراض المساهمة في النماذج الحيوانية 6. في هذا البروتوكول وصفنا نموذج إعداد الأنسجة خارج الحي الذي يسمح بتقييم مباشر ومترجم من سلامة الأمعاء والتي يمكن استخدامها لتقييم وظيفة حاجز المخاطية في عدد من المستويات. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج حيوانية من المرض، أو قد يتم التلاعب بها دواء للسماح في عمق الاستجواب من ضعف الغشاء المخاطي الحاجز.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن في تفصيل العزلة وإعداد الحويصلات في الأمعاء لتقييم وظيفة حاجز المخاطية خارج الحي. وقد استخدمت الاستعدادات كيس معوي في المقام الأول في مجال البحوث الدوائية، دراسة امتصاص الأدوية مرشح عبر الأمعاء. ومع ذلك، هذا الاختبار هو على قدم المساواة مناسبة تماما ل?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an ‘enteric tear’ mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer’s patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
