Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
La barriera epiteliale è la prima difesa innata del tratto gastrointestinale e regola selettivamente trasporto dal lume ai compartimenti sottostanti, limitare il trasporto di molecole più piccole attraverso l'epitelio e quasi completamente vieta epiteliale trasporto macromolecolare. Questa selettività è determinata dallo strato di gel mucoso, che limita il trasporto di molecole lipofile ed entrambi i recettori apicali e stretti complessi proteici giunzionali dell'epitelio. Modelli in vitro su colture di cellule dell'epitelio sono convenienti, ma come un modello, non hanno la complessità delle interazioni tra microbiota, muco-gel, epitelio e il sistema immunitario. D'altra parte, la valutazione in vivo dell'assorbimento intestinale o permeabilità può essere eseguita, ma questi test misurare il grado di assorbimento gastrointestinale, senza alcuna indicazione di specificità del sito. Ex vivo saggi permeabilità utilizzando "sacche intestinali"; sono un metodo rapido e sensibile per misurare sia l'integrità intestinale globale o il trasporto comparativa di una molecola specifica, con l'ulteriore vantaggio di specificità del sito intestinale. Qui si descrive la preparazione di sacche intestinali per gli studi di permeabilità e il calcolo della permeabilità apparente (P app) di una molecola attraverso la barriera intestinale. Questa tecnica può essere utilizzata come un metodo di valutazione assorbimento del farmaco, o per esaminare disfunzione barriera epiteliale regionale in modelli animali di malattia gastrointestinale.
Introduction
La barriera epiteliale intestinale del tratto gastrointestinale è una superficie mucosa stimato a 400 m 2 nel umano adulto. Di conseguenza, si è costantemente esposto a sfidare da microbi, farmaci ingeriti, nutrienti e tossine batteriche. L'host non solo deve distinguere tra batteri commensali tollerabili e potenziali patogeni, ma deve impedire queste specie e loro molecole secrete di attraversare la barriera epiteliale, mentre allo stesso tempo permette l'assorbimento dei nutrienti. Pertanto, il ruolo dell'epitelio intestinale è di agire come barriera selettiva al contenuto luminale 1. Questo risultato è ottenuto, in parte, dal sistema di difesa epiteliale innato alla mucosa, che agisce attraverso un sistema biologico reattivo costituito da costitutive e inducibili meccanismi 2.
La perdita della funzione barriera epiteliale è una patologia che è caratteristica di un certo numero di malattie gastrointestinali. In vivoesame della funzione di barriera epiteliale può essere valutata attraverso sonda gastrica di una molecola tracciante e la successiva analisi del siero 3. Tuttavia, questa tecnica non offre alcuna indicazione sul sito di disfunzione barriera. In vitro e ex vivo valutazione della resistenza transepiteliale utilizzando sistemi Transwell 3 e ussing rispettivamente camere di 4,5, sono comunemente impiegati come indicatori surrogati di funzione di barriera epiteliale, ma manca la contribuendo malattia fisiologia dei modelli animali 6. In questo protocollo si descrive un modello di preparazione del tessuto ex vivo che permette una valutazione diretta e localizzata dell'integrità intestinale e che può essere utilizzato per valutare la funzione barriera della mucosa a diversi livelli. È importante sottolineare che questa tecnica può essere applicata a modelli animali di malattia, o può essere farmacologicamente manipolato per permettere a fondo interrogatori di disfunzione barriera mucosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto l'isolamento e la preparazione di sacche intestinali per valutare la funzione barriera della mucosa ex vivo. preparazioni sac intestinali sono principalmente utilizzati nella ricerca farmaceutica, esaminando l'assorbimento di farmaci candidati attraverso l'intestino. Tuttavia, questo test è ugualmente adatta per lo studio della malattia intestinale. La permeabilità intestinale può variare notevolmente da regione a regione e la valutazione specifica del sito di permeabilità…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
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