예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
상피 장벽 위장관 제 타고난 방어 선택적 작은 상피 걸쳐 분자와 거의 상피 고분자 전송 금지의 이동을 제한하는 하부 조직 구획 루멘으로부터 수송을 조절한다. 이 선택은 친 유성 분자 양쪽 정점 수용체 상피 단단한 접합부 단백질 복합체의 전송을 제한 점액 겔 층에 의해 결정된다. 상피 세포의 시험 관내 세포 배양 모델은 편리하지만, 모델, 그들은 부족한 미생물, 점액 젤, 상피 세포와 면역 체계 사이의 상호 작용의 복잡성. 한편, 사이트 특이성 표시없이 장내 흡수 또는 투과율의 생체 내 평가를 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 전체 위장관 흡수를 측정한다. 생체 외 투과 검정을 "장 주머니"를 사용하여; 장 사이트 특이성의 추가적인 장점으로, 전체 장 무결성 또는 특정 분자의 비교 수송를 측정하는 신속하고 민감한 방법입니다. 여기에서 우리는 투과성 연구를위한 장 주머니의 준비 및 명백한 투자율 (P 응용 프로그램)의 계산을 설명 장 장벽을 가로 지르는 분자. 이 기술은 평가 약물 흡수의 방법으로 사용할 수도 있고, 위장관 질환의 동물 모델에서의 지역 상피 장벽 기능 장애를 조사.
Introduction
위장관 장 상피 장벽 인간 성인 400 평방 미터로 추정 점막 표면적이다. 따라서, 지속적 미생물 섭취 약물, 영양분 및 박테리아 독소의 도전에 노출된다. 호스트는 허용 공생 박테리아 병원균 구분하지해야하지만 동시에 영양소 흡수를 허용하면서, 상피 장벽을 넘어에서 이러한 종의 분자 및 분비를 방지한다. 따라서, 장 상피 세포의 역할은 내강 내용 1 선택적 장벽으로 작용한다. 이 구성 적 및 유도 메커니즘이 이루어진 반응 시스템을 통해 생물학적 작용 점막 상피에서 타고난 방어 시스템에 의해 부분적으로 달성된다.
상피 장벽 기능의 상실은 위장관 질환의 특징 인 다수의 병리이다. 생체를상피 장벽 기능의 검사는 추적 분자의 구강 투여 이후 혈청 분석 (3)를 통해 평가 될 수있다. 그러나,이 기술은 장벽 기능 장애의 사이트에 같은 징후를 제공하지 않습니다. 생체 외 및 트랜스 웰 시스템 (3)를 사용하여 각각 챔버 4,5 Ussing transepithelial 저항의 생체 평가에서 일반적으로 상피 장벽 기능의 대리 지표로 사용하지만, 동물 모델 (6)의 기여 질병 생리학 부족합니다. 이 프로토콜에서는 다수의 레벨에서 점막 장벽 기능을 평가하는데 사용될 수있다 장 무결성 및 직접 지역화 평가 수 생체 조직 준비 모델을 설명한다. 중요한 것은,이 방법은 질환의 동물 모델에 적용 할 수 있거나, 또는 그의 약학 적 점막 방벽 기능 부전의 깊이 질의에서 허용하도록 조작 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 점막 장벽 기능 생체을 평가 단리 장내 주머니의 제조 상세한있다. 소장 SAC 제제는 주로 소장 전체 후보 약물의 흡수를 시험하는 제약 연구에서 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석은 동일하게 장 질환의 연구를 위해 적합하다. 지역 및 투과성의 사이트에 특정 평가에 따라 크게 다를 수 있습니다 장 투과성은 소화 질환 점막의 무결성의 지역 중요성에 대한 이해를 할 수 있습니다….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an ‘enteric tear’ mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer’s patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
