Microbiologicamente induzida Calcita Precipitation Mediada por<em> Sporosarcina pasteurii</em

Summary

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Abstract

A bactéria em particular sob investigação aqui (S. pasteurii) é única em sua capacidade, sob as condições certas, para induzir a hidrólise da uréia (ureolysis) em que ocorre naturalmente ambientes através da secreção de uma enzima urease. Este processo de ureolysis, através de uma cadeia de reacções químicas, conduz à formação de precipitados de carbonato de cálcio. Isto é conhecido como microbiologicamente Induzida calcite Precipitação (MICP). Os protocolos de cultura adequados para MICP são detalhados aqui. Finalmente, as experiências de visualização sob diferentes modos de microscopia foram realizados para compreender vários aspectos do processo de precipitação. Técnicas como microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e X-Ray Photo-elétron Spectroscopy (XPS) foram empregadas para caracterizar quimicamente o produto final. Além disso, a capacidade destes precipitados para obstruir os poros no interior de um meio poroso natural foi demonstrado através de uma experiência qualitativa onde esponjabarras foram utilizadas para imitar uma poro de rede com uma gama de escalas de comprimento. Uma barra de esponja embebida em meio de cultura contendo as células bacterianas endurece devido ao entupimento dos seus poros resultantes do processo contínuo de precipitação química. Esta barra de esponja endurecida apresenta uma resistência superior quando comparada com uma barra de esponja de controlo que fica comprimido e espremido sob a acção de uma carga externa aplicada, enquanto a barra endurecida é capaz de suportar o mesmo peso com pouca deformação.

Introduction

Sporosarcina pasteurii é uma bactéria gram-positiva capazes de sobreviver em ambientes altamente alcalino (pH ~ 10) ^um e é uma das espécies de bactérias que podem tornar-se um agente causador de um fenómeno chamado microbiologicamente Induzida calcite Precipitação (MICP) ^2-4. MICP é um processo em que a precipitação de carbonato de cálcio é induzida por certos microorganismos sob condições ambientais adequadas. S. pasteurii assumiu importância nos últimos anos devido à sua identificação como possível agente para induzir volumes significativos de MICP sob certas condições. Esta possibilidade resulta do facto de S. pasteurii tem a capacidade única para secretar grandes quantidades de enzima urease. Esta enzima actua como um catalisador, que promove uma lise acelerada de ureia (um composto bioquímico que ocorre naturalmente com o fornecimento generalizada e abundante) na presença de moléculas de água. Através de uma cascata de reacções, neste processo finalLY conduz à geração de iões carbonato carregados negativamente. Estes iões, por sua vez, reagir com os iões de metal como cálcio positivos para finalmente formar precipitados de carbonato de cálcio (calcite); portanto, a etiqueta MICP ^5-9.

O processo de MICP foi conhecida e estudada por várias décadas ^10,11. Ao longo dos últimos anos, MICP foi investigado por uma ampla gama de engenharia e ambientais, incluindo a de baixo para cima construção verde ^12, melhoria de estruturas de grande escala ^13,14 e sequestro e armazenamento de carbono ^15,16.

Por exemplo, Cunningham et ^17. al projetado um reator de fluxo de temperatura moderada alta pressão contendo um núcleo de arenito Berea. O reactor foi inoculado com a bactéria S. fridgidimarina e sob condições de injecção de dióxido de carbono supercrítico de alta pressão, uma acumulação maciça de biomassa no interior do volume de poroumes foi observado, o que levou a uma redução superior a 95% da permeabilidade. Jonkers e Schlangen ¹⁸ estudaram o efeito de certas estirpes de bactérias especiais sobre o processo de auto-cura em concreto. água externa transportados para a rede de poros entrar através dos poros da superfície é esperado para ativar as bactérias dormentes que por sua vez ajudam a resistência estrutural via MICP. Tobler ¹⁹ et al. compararam a atividade ureolítica de S. pasteurii com um subterrâneas ureolítica microcosmo indígena sob condições que favorecem MCIP grande escala e descobriu que S. pasteurii tem uma capacidade consistente para melhorar a precipitação de calcita, mesmo quando as comunidades indígenas não tinham actividade da urease prévio. Mortensen ²⁰ et.al estudaram os efeitos de fatores externos, como o tipo de solo, a concentração de cloreto de amônio, salinidade, concentração de oxigênio e lise de células na MICP. Sua demonstração de que o processo de tratamento biológico é muito robusto com respect a uma grande variação no espaço de parâmetros substancia a aptidão deste processo para várias aplicações de reparação de grande escala proporcionado um processo de enriquecimento adequada para reforçar a bactéria é levada a cabo. Phillips et ^21. al concebido experimentos para estudar as alterações na permeabilidade e força de uma coluna de areia e um núcleo de arenito depois de ser injetado com S. culturas pasteurii. Eles descobriram que enquanto que a permeabilidade diminuída 2 – 4 vezes enquanto que a resistência à fractura aumentou três vezes.

S. pasteurii e seu papel na MICP são tópicos de pesquisa ativa e várias questões relacionadas com o mecanismo de precipitação química ainda não são totalmente compreendidos. À luz disto, é muito importante ter um conjunto de protocolos padronizados consistentes com precisão a cultura um estoque adequadamente enriquecida de S. pasteurii para alcançar MICP. Aqui, descrevemos um protocolo rigoroso, que irá garantir a repetibilidade ea reprodutibilidade. este manuscript descreve os protocolos detalhados para a cultura de S. pasteurii e adequadamente enriquecimento do meio de cultura para induzir a precipitação. O processo é investigada através de várias técnicas microscópicas, tais como óptica e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e X-Ray Photo-elétron Spectroscopy (XPS). O foco do manuscrito está no processo de MICP. Procedimentos como SEM e Sims, sendo os protocolos padrão bem conhecidos, não são descritos separadamente.

Protocol

NOTA: Execute os protocolos experimentais na ordem descrita abaixo. O protocolo de cultura bacteriana é discutido na Seção 1 (ver também Figura 1). Secção 2 descreve o protocolo para o enriquecimento do meio de cultura utilizando aditivos externos. Seção 3 descreve os protocolos de microscopia multi-modo. Os pesos de todos os componentes individuais podem ser medida utilizando uma balança analítica. O volume de cada solução pode ser medida utilizando um cilindro volumétrico. <p class="j…

Representative Results

S. pasteurii ser um Alcalifilo 24 podem sobreviver a condições relativamente severas. Quando o protocolo de cultura acima mencionado é seguido, e S. pasteurii é cultivado dentro de uma câmara, as bactérias conduz à precipitação de carbonato de cálcio ao longo do tempo (Figura 2A). A Figura 2 (b) mostra uma imagem de contraste de fase microscópica óptica da população celular bacteriana dentro do meio de cultura. …

Discussion

Passos críticos: Este manuscrito descreve em detalhes os protocolos para a cultura de uma amostra viável de S. pasteurii. Uma vez que a cultura foi preparado, ele deve ser apropriadamente enriquecido. Este é um passo chave essencial para o sucesso da experiência, pois uma falha para proporcionar o ambiente químico adequado leva a qualquer escala de tempo muito longos de precipitação ou de uma completa falta dela. S. pasteurii é bastante sensível a vários órgãos externos e d…

Materials

Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium