Mikrobiologiskt inducerad Calcite Nederbörd medierad av<em> Sporosarcina pasteurii</em

Summary

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Abstract

Den särskilda bakterien under utredning här (S. pasteurii) är unik i sin förmåga, under rätt förutsättningar, för att inducera hydrolys av urea (ureolysis) i naturligt förekommande miljöer genom utsöndring av en enzymet ureas. Denna process av ureolysis, genom en kedja av kemiska reaktioner, leder till bildning av kalciumkarbonat fällningar. Detta kallas Mikrobiologiskt Induced Calcite Nederbörd (MICP). De korrekta kulturprotokoll för MICP beskrivs här. Slutligen tillsattes visualiserings experiment under olika typer av mikroskopi utförs för att förstå olika aspekter av utfällningsprocessen. Tekniker som optisk mikroskopi, var Svepelektronmikroskopi (SEM) och röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) användes för att kemiskt karakterisera slutprodukten. Vidare har förmågan hos dessa fällningar för att täppa till porerna i en naturlig poröst medium påvisas genom en kvalitativ experiment där svampbarer användes för att efterlikna en por-nätverk med ett utbud av längdskalor. En svamp bar doppas i odlingsmedium som innehåller de bakteriella cellerna hårdnar på grund av igensättning av dess porer till följd av det kontinuerliga förfarandet enligt kemisk fällning. Detta härdade svamp bar uppvisar överlägsen styrka jämfört med en kontroll svamp bar som blir komprimerad och pressas under inverkan av en pålagd yttre belastning, medan den härdade bar kan stödja samma vikt med liten deformation.

Introduction

Sporosarcina pasteurii är en grampositiv bakterie kan överleva i starkt alkaliska miljöer (pH ~ 10) ¹ och är en av de bakteriearter som kan bli en smittämnen av ett fenomen som kallas Mikrobiologiskt Induced Calcite Nederbörd (MICP) ^2-4. MICP är ett förfarande varvid utfällning av kalciumkarbonat induceras av vissa mikrober under lämpliga miljöförhållanden. S. pasteurii har antagit betydelse under de senaste åren på grund av dess identifiering som ett möjligt medel för att framkalla betydande volymer av MICP under vissa förutsättningar. Denna möjlighet härrör från det faktum att S. pasteurii har en unik förmåga att utsöndra stora mängder av enzymet ureas. Detta enzym fungerar som en katalysator, främja en accelererad lys av urea (en naturligt förekommande biokemisk förening med utbredd och rikligt utbud) i närvaro av vattenmolekyler. Genom en kaskad av reaktioner, denna process ultimataly leder till generering av negativt laddade karbonatjoner. Dessa joner, i sin tur, reagera med positiva metalljoner som kalcium för att slutligen bilda utfällningar av kalciumkarbonat (kalcit); hence etiketten MICP ^5-9.

Processen för MICP har varit kända och studerats under flera decennier ^10,11. Under de senaste åren har MICP undersökts för ett brett spektrum av tekniska och miljömässiga tillämpningar, inklusive bottom-up grönt byggande ^12, förstärkning av storskaliga strukturer ^13,14 och avskiljning av koldioxid och lagring ^15,16.

Till exempel, Cunnigham ¹⁷ et. al utformat en högtrycks måttlig temperatur flödesreaktor innehållande en Berea sandsten kärna. Reaktorn ympades med bakterier S. fridgidimarina och under förhållanden med superkritisk koldioxid injektion högtrycks, en massiv ansamling av biomassa inuti pore volvolymerna observerades, vilket ledde till mer än 95% reduktion i permeabilitet. Jonkers och Schlangen ¹⁸ studerade effekten av vissa särskilda bakteriestammar på självläkande process i betong. Extern vatten transporteras in i pornätverket in genom ytan porerna förväntas att aktivera vilande bakterier som i sin tur bidrar till strukturell styrka via MICP. Tobler ¹⁹ et al. har jämfört ureolytic aktiviteten hos S. pasteurii med en inhemsk grundvatten ureolytic mikrokosmos under betingelser som gynnar storskalig MCIP och fann att S. pasteurii har en konsekvent förmåga att förbättra kalcit nederbörd även när ursprungsbefolkningen saknade tidigare ureasaktivitet. Mortensen ²⁰ et.al har studerat effekterna av yttre faktorer som jordart, koncentration av ammoniumklorid, salthalt, syrehalt och lys av celler på MICP. Deras demonstration att den biologiska reningsprocessen är mycket robust med respect till en stor variation i parameterrymden bestyrker lämplighet av denna process för olika storskaliga sanering program som tillhandahålls en riktig anrikningsprocessen för att förstärka bakterierna görs. Phillips ²¹ et. al utformade experiment för att studera förändringar i permeabilitet och styrka av en sand kolonn och en sandsten kärnan efter injicerades med S. pasteurii kulturer. De fann att medan genomsläppligheten minskade 2 – 4 gånger medan brotthållfastheten ökade tre gånger.

S. pasteurii och dess roll i MICP är ämnen av aktiv forskning och flera frågor som rör mekanismen för kemisk fällning fortfarande inte helt klarlagda. Mot bakgrund av detta är det mycket viktigt att ha en uppsättning konsekventa standardiserade protokoll för att noggrant kultur en lämpligt anrikad lager av S. pasteurii att uppnå MICP. Här, vi beskriva en rigorös protokoll som garanterar repeterbarhet och reproducerbarhet. denna manuscript beskriver detaljerade protokoll för odling S. pasteurii och på lämpligt sätt berika odlingsmediet för att inducera fällning. Processen undersöks genom olika mikroskopiska tekniker såsom optisk och svepelektronmikroskopi (SEM) och röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS). Fokus i manuskriptet är på processen för MICP. Rutiner som SEM och SIMS, som är väletablerade standardprotokoll, beskrivs inte separat.

Protocol

OBS: Utför experimentella protokoll i den ordning som beskrivs nedan. Bakteriekulturen protokollet diskuteras i avsnitt 1 (se även figur 1). Avsnitt 2 beskriver protokollet för att berika odlingsmediet med hjälp av externa tillsatser. Avsnitt 3 beskriver protokoll för multi-mode mikroskopi. Vikter av alla de individuella komponenterna kan mätas med användning av en analytisk våg. Volym av varje lösning kan mätas med användning av en volumetrisk cylinder. OBS: Korr…

Representative Results

S. pasteurii vara en alkaliphile 24 kan överleva relativt svåra förhållanden. När det ovan nämnda odlingsprotokoll följs, och S. pasteurii odlas inuti en kammare, bakterierna leder till utfällning av kalciumkarbonat med tiden (figur 2A). Figur 2 (b) visar ett faskontrast optisk mikroskopisk bild av den bakteriella cellpopulationen inom odlingsmediet. Individuella celler kan klart skiljas, med stavliknande former är k…

Discussion

Kritiska steg: Detta manuskript beskriver i detalj protokollen för odling av en livskraftig prov av S. pasteurii. När kulturen har readied, måste det vara lämpligt berikas. Detta är ett viktigt steg avgörande för framgången av försöket eftersom en underlåtenhet att tillhandahålla den rätta kemiska miljön leder till antingen mycket långa tidsskalor av nederbörd eller en fullständig brist på sådan. S. pasteurii är ganska känslig för flera externa organ och måste od…

Materials

Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium