Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen

Summary

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Abstract

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

Introduction

The actin cytoskeleton that determines the shape, polarity and migratory properties of mammalian cells is regulated by the Rho-family of small GTPases. The Rho-family GTPases include RhoA that stimulates cytoskeletal contraction, Rac1 that stimulates actin branching and membrane protrusion, and Cdc42 that has similar effects on actin polymerization to Rac1 and causes the formation of filopodia ^1,2. GTPase signaling activity is determined by binding of a nucleotide, which controls the contraction and relaxation of the switch I and switch II loops that mediate the protein-protein interactions with both regulators and effectors. Guanosine 5’-triphosphate (GTP)-bound GTPases activate downstream effectors, whereas the Guanosine 5’-diphosphate (GDP)-bound form is inactive. In the cell, cycles of GTP hydrolysis and nucleotide exchange allow rapid turnover of GTPase signals that are necessary for cytoskeletal dynamics. Nucleotide turnover is regulated by three mechanisms. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) stabilize the nucleotide-free GTPase, catalyzing exchange of GDP for GTP, and thereby stimulating GTPase signaling activity ^3,4. GTPase-activating proteins (GAPs) catalyze hydrolysis of GTP to GDP, thereby inhibiting GTPase signaling activity ⁵. Sequestering molecules such as regulator of chromatin condensation 2 (RCC2) and guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) obscure the switch loops and in the case of GDIs remove the GTPase from the membrane by interaction with the prenyl tail ^6,7. Each of the three classes of regulatory molecule interact with the switch loops, as do the downstream effectors and some trafficking regulators such as coronin-1C ⁷. The purpose of this protocol is to measure competition for the switch I/II binding site between putative regulators and downstream signaling molecules. It should be noted that competition assays test binding to a shared binding site, so that this protocol is not suitable for testing interactions with other sites, such as binding of GDIs to the prenyl tail.

The subtlety of the conformation differences between active and inactive forms, combined with the labile nature of the bound nucleotide, has made study of GTPase-binding events difficult. The role of the bound nucleotide means that conventional binding assays such as immunoprecipitation or surface plasmon resonance are not well suited to investigation, as the nucleotide cannot be controlled. This obstacle is compounded by the overlap in the binding sites of GEFs, GAPs, effectors, sequestering molecules and trafficking molecules, which make binding data for a single interaction difficult to interpret in the context of the competition that will occur in the cell. Immunoprecipitation, in particular, is compromised by competition between binding partners, as under certain cellular conditions, one binding partner might be identified at the expense of all others, while under other conditions, another partner might dominate. The dynamic nature of GTPase signaling is essential to GTPase function and must be considered when analyzing the relationships between the binding interactions of different regulators. Indeed, we recently described a pathway that relied heavily on competitive binding. We identified coronin-1C as a trafficking molecule that bound to the switch loops of GDP-Rac1 ⁷. In areas of low GEF activity, trafficking would dominate, removing Rac1 from those regions. However, when Rac1 is delivered to regions of the cell where GEF activity is high, the GEF would outcompete coronin-1C, thereby both activating Rac1 and preventing coronin-1C-mediated removal of Rac1 from that area. The model goes further, because the action of the GEF exchanges bound GDP for GTP, shifting the equilibrium still further from coronin-1C. Consequently, Rac1 activity could be explained entirely in terms of competition and relative affinity.

In this protocol, we describe a method for comparing the relative affinities of different binding partners for small GTPases, using Rac1 as an example. By using a purified protein approach, it is possible to piece together a chain of signaling events by pair wise comparison, in an experiment where the bound nucleotide can be closely controlled.

Protocol

1. Zuivering van GST-gelabeld GTPase Cultuur een E. coli-stam zoals BL21 getransformeerd met pGEX-Rac1 O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 220 rpm in 500 ml autoinductie medium (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2PO 4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl2, 0,5% glycerol, 0,05% glucose, 0,2% lactose, 5 g trypton, 2,5 g gistextract, 100 ug / ml ampicilline). Harvest bacteriën door centrifugeren gedurende 10 min bij 10.000 xg, 4 ° C. Resuspendeer bacteriële pellet in 20 ml eiwit extractie reagens, 1x proteaseremmer en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met omkering. Verduidelijken het lysaat door centrifugatie bij 40.000 xg gedurende 30 min. Voeg 2 ml glutathion magnetische korrels, gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Incubeer 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C. Was-eiwit beladen korrels vier keer met 10 ml PBS, met behulp van een magnetisch deeltje sorter aan de korrels bij elke stap precipiteren. Resuspendeer proteïne-beladen kralen in 2 ml PBS en bewaar bij -80 ° C in 100 gl aliquots tot gebruik. 2. Expressie van GTPase-bindende eiwitten De dag voor het experiment, transfectie van plasmiden coderend voor groen fluorescent eiwit (GFP) gemerkte versies van elk GTPase-bindend eiwit in een afzonderlijke 75-cm2 kolf van HEK293T als volgt. Voor de validatie van nucleotide laden, transfecteren GFP-gelabeld TrioD1 in een derde 75-cm 2 kolf van HEK293T. Verdun polyethylamine tot 1 mg / ml in 100 pl steriel 150 mM NaCl. Voeg 27 ul verdund polyethylamine tot 223 ui verminderd serum media. Voeg 12 ug plasmide-DNA met 250 ul gereduceerd serum medium. Incubeer elke buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li> Combineer de polyethylamine en DNA mengt in een enkele buis en vortex gedurende 2 min. Incubeer 15-20 minuten bij kamertemperatuur. Vervang het groeimedium (Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, zonder antibiotica) met 90% confluent HEK293T met 5 ml vers kweekmedium. Voeg de gecombineerde polyethylamine / DNA mengsel aan de kolf en geïncubeerd O / N bij 37 ° C, 5% CO2. 3. Zuivering van GTPase-bindingseiwitten Spoel kolven van getransfecteerde cellen in PBS en afvoer kolf gedurende 5 min, aspireren van vrije vloeistof. Schraap cellen in 500 pi lysisbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x proteaseremmer) in microcentrifugebuis. Lyse cellen door mengen door omkeren bij 4 ° C gedurende 30 min. Tijdens lysis wassen twee partijen 40 pl GFP-Trap parels driemaal met verse lysisbuffer, sedimenteren kralen aan 2700 xg gedurende 2 min tussen wasbeurten. Verduidelijken lysaten door centrifugatie bij 21.000 xg gedurende 10 min. Overdracht geklaarde lysaat van elke deelnemer eiwitten gewassen GFP-trap parels gescheiden en laten GFP-fusie-eiwitten te binden voor 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C. Houd lysaat van GFP-TrioD1 cellen op ijs. Wassen geladen GFP-Trap kralen tweemaal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 en tweemaal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 , sedimenteren kralen aan 2700 xg gedurende 2 min tussen de wassingen. Elueer GFP-fusie-eiwitten door toevoeging van 40 pi 0,2 M glycine (pH 2,5) en op en neer pipetteren van 30 sec. Onmiddellijk sediment korrels bij 21.000 xg gedurende 60 s en overdrachtvloeistof een nieuwe microcentrifugebuis bevattende 4 pi 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Doe dit snel tot beschadiging van het gezuiverde eiwit te beperken. Analyseer 1 pi van elke gezuiverde eiwit door Western blot en probe met een anti-GFP antilichaam relatieve rendement stellen via een kwantitatief blotting volgens het protocol van de fabrikant. Alternatief bepalen eiwitconcentraties van bicinchoninezuur (BCA) assay maar dit introduceert fouten als de eiwitten reageren niet met de assay op een identieke wijze of er verontreinigende eiwitten. Equalize molaire eiwitconcentratie door de toevoeging van 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2. 4. Nucleotide laden van GTPase Dooi een hoeveelheid van GST-Rac1 magnetische korrels, bereid in stap 1. Neem 90 pi GST-Rac1 kralen en was driemaal met 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, met een magnetische deeltjes sorter aan de korrels bij elke stap precipiteren. Aspireren buffer kralen en voeg 100 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA. Naargelang BBP, GTP of geen nucleotide lading is vereist voor het vergelijkend experiment, voeg 12 ul 100 mM BBP, 12 gl 10 mM guanosine 5 '- [γ-thio] trifosfaat (GTPyS) of geen nucleotide 60 gl GST-Rac1 kralen. Voor de nucleotide-loading controles splitsing van de resterende kralen in drie 10-ul monsters en voeg 2 pl 100 mM BBP, 2 pl 10 mM GTPyS of geen nucleotide aan elke buis. Incubeer bead mixen voor 30 min bij 30 ° C onder roeren. Stabiliseer-nucleotide gebonden Rac1 door toevoeging van 1 M MgCl 2: 3 pi de experimentele mix (stap 4,4), 0,5 pi aan elk controlepunt mengsels (stap 4,5). 5. Mededinging bindend. Opgezet 6 microfugebuizen buizen, elk met: 200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 10 ul experimenteel-nucleotide beladen Rac1 kralen (van stap 4.7) 5 gl Rac1-bindend eiwit A (constant bindingseiwit) Aan elke buis, voeg 0, 1, 2,5, 5, 10 of 20 gl-Rac1 bindende eiwit B (variabele bindend eiwit). Deze volumes veronderstellen eenpproximately gelijke stock concentraties van de constante en variabele bindingseiwitten en moet mogelijk worden aangepast. Pas volumes bindende eiwitten A en B als er grote verschillen in de bindingsaffiniteiten van de twee eiwitten en dit moet empirisch worden bepaald door experimentele herhalingen. Vul het totale volume van het mengsel binding aan 235 pl door toevoeging van 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2. Het opzetten van een microfugebuis bevat: 200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 10 ul experimenteel-nucleotide beladen Rac1 kralen (van stap 4.7) 10 gl Rac1-bindend eiwit A (constant bindingseiwit) Het opzetten van het BBP, GTPyS en geen nucleotide controle buizen: 200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 10 ul controle Rac1 kralen in stap 4.5 met het BBP, GTPyS of geen nucleotide geladen en gestabiliseerd in stap 4.7. 180 pi HEK293T GFP-TrioD1 lysaat, bereid als in stap 3,6 4 gl 1 M MgCl2 Incubeer het mengsel gedurende 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C. Was de parels driemaal met 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2. Elueer eiwitten in 20 gl verminderen monsterbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glycerol, 0,02 mg / ml broomfenolblauw, 5% β-mercaptoethanol). 6. Analyse van de concurrentie Los 10 ul van het gebonden eiwit (stap 5,6) van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en Western blot. Incubeer het membraan bij 4 ° CO / N anti-GFP antilichaam verdund 1/1000 in de blokkeerbuffer verdund tot 1x in PBS, 0,1% Tween-20 voor beide gelabelde GTPase-bindende eiwitten te detecteren. Was het membraan drie keer gedurende 10 min met PBS, 0,1% Tween-20. Incubeer het membraan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in DyLight 800-geconjugeerd anti-konijn secmiddelbaar antilichaam, verdund 1 / 10.000 in blockingbuffer verdund tot 1x in PBS, 0,1% Tween-20. Was het membraan drie keer gedurende 10 min met PBS, 0,1% Tween-20. Scan het membraan met behulp van een infrarood beeldvormingssysteem via de software bandintensiteit meten volgens het protocol van de fabrikant. Plot van de band intensiteit van elk eiwit tegen volume van de variabele concurrent (Protein B). Verdeel het volume van variabele deelnemer op het punt waar de lijnen elkaar snijden door het volume constant concurrent (Proteïne A, 5 ui) aan de deelnemer welke verhouding evenwicht wordt bereikt bepalen. Voor validatie van nucleotide-beladingsstatus, probe membranen voor p21-geactiveerd kinase 1 (PAK1) (een effector) en GFP-TrioD1 (a GEF), zoals beschreven in stappen 6,1-6,6.

Representative Results

Dit protocol is bedoeld om de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rac1 berekenen zonder de exacte concentratie van de concurrenten kennen (Figuur 1). Bepaling van de eiwitconcentratie en introduceert fouten bij het overwegen concurrentie tussen moleculen in een signaleringsroute is niet noodzakelijk. Het is echter belangrijk te weten dat de twee concurrenten dezelfde molaire concentratie van de voorraadoplossingen om eenvoudige verhoudingen worden berekend bij het toevoegen van verschillende hoeveelheden tot de assay. 40 pl GFP-Trap kralen hebben een bindingscapaciteit van ~ 300 pmol dus confluente 75 cm2 kolven sterk tot expressie brengende cellen zullen verzadigen de korrels, waardoor de voorbereiding van de twee verschillende bindingseiwitten vergelijkbaar voor correctie wordt (figuur 2A). Als één van de eiwitten tot expressie slecht, kan dit probleem worden ondervangen door het zuiveren van eiwitten die uit meer dan één kolf cellen. <p class = "jove_content"> De binding van de meeste GTPase effectoren en regulatoren afhankelijk van de nucleotide laden van het aas GTPase, dus is het belangrijk om te testen of het laden succesvol is geweest. Laden kan worden geverifieerd door neerslaan bekend bindende eiwitten uit cellysaten. Effector eiwitten zoals PAK1 binden aan GTP-Rac1 en kan gemakkelijk worden geprecipiteerd uit lysaten en gedetecteerd door Western blotting 8 (figuur 2B). GEFs voorkeur binden aan nucleotide-vrij GTPase de overgangstoestand te stabiliseren. Als GEFs zijn van lage overvloed, meestal inactief en vaak vlek slecht, het is beter om een ​​GEF of GEF fragment te testen-nucleotide vrij GTPase overexpressie. We gebruiken vaak het eerste Dbl homologie van Trio, uitgedrukt GFP-fusie (GFP-TrioD1 9) (figuur 2B), maar elke GEF zou werken. Eiwitten die zich binden aan de BBP geladen GTPase zijn zeldzamer. We hebben onlangs gemeld RCC2 als een dergelijk eiwit 7 of bbp-laden kan eenvoudig worden gevalideerd als Binding noch GEF noch effector. De uitvoer van het experiment een Western blot die de twee GFP-gelabeld bindingspartners gebonden aan de GTPase zijn. Door een antilichaam tegen beide eiwitten te detecteren, kunnen de concentraties waarbij gelijke hoeveelheden van beide deelnemers binden worden bepaald en daarmee de relatieve affiniteiten afgeleid. In dit voorbeeld competitie tussen de propeller domein van de Rac1-eiwit trafficking, coronin-1C (Rac1-bindend proteïne A) en de Rac1-sequesterende eiwit RCC2 (Rac1-bindend eiwit B), is aangetoond (figuur 3A). Door het gebruik van een constant volume van coronin-1C propeller (5 pi) en toenemende hoeveelheden RCC2 toe te voegen, kunnen we zien aan de GFP uitwissen dat evenwicht wordt bereikt bij 1,25-2,5 ul RCC2 (asterisk), waaruit blijkt dat RCC2 heeft een sterkere affiniteit voor Rac1 dan coronin-1C. Door het meten van de intensiteit van de banden met behulp van kwantitatieve Western blotting en plotten gemiddelde waarden voor elke competitor, kan het evenwichtspunt nauwkeurig worden berekend door de volumes waarbij de curves snijden (figuur 3B) identificeren. Een van de mogelijke obstakels voor succesvolle competitie assay is als de bindingspartners aan elkaar binden en binding aan Rac1. In figuur 3A + B tonen we concurrentie tussen RCC2 en de propeller domein van coronin-1C, in plaats full-length coronin-1C. De reden om het afgeknotte coronin dat coronin-1C bindt ook RCC2 via staartdomein. Wanneer full-length coronin-1C is getitreerd tegen RCC2, binding van beide eiwitten wordt gedetecteerd, als gevolg van ternair complex vorming, in plaats van de concurrentie (Figuur 3C). Als de concurrentie plaatsvindt, het binden van een eiwit zal toenemen, terwijl de andere afneemt, en de totale gebonden GFP-fusie zal constant blijven. In gevallen waarin een ternair complex vormt moet een van de GTPase-eiwit afkappen zodat de competsatoren niet meer communiceren. Figuur 1. Workflow. Schematische weergave van de workflow voor het bepalen van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp van concurrentie assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. Validatie van gezuiverde eiwitten. (A) Gezuiverd-GFP-gelabeld Rac1 bindende eiwitten op Western blot geanalyseerd, probing met anti-GFP om de relatieve opbrengst van beide eiwitten te bepalen. Dit type egalisatie tijdens het experiment maakt de concentratie van de twee eiwitten worden aangepast zodat ze overeenkomen met het bindingsexperiment. (B) GDP, GTPyS en no-nucleotide geladen GST-Rac1 werd geïncubeerd met lysaat van HEK293T die GFP-TrioD1 en gebonden gedetecteerd door het plotten van endogene PAK1 of overexpressie GFP-TrioD1 eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3 Western blot-analyse van relatieve eiwitbinding. Voorbeeld output van competitie-bindingstesten. (A) BBP geladen Rac1 werd gemengd met 5 pl GFP-coronin 1C-propeller domein en toenemende GFP-RCC2 werden getitreerd. Door Western blotting eiwitten voor GFP, problemen met differentiële detectie van de twee eiwitten worden vermeden en het GFP-signaal rapporteert de molaire verhouding tussen de twee fusie-eiwitten. Sterretjes geven de verhoudingen concurrentie op either zijde van het evenwichtspunt. (B) bandintensiteiten gebonden GFP fusie-eiwitten van drie onafhankelijke experimenten werden gemeten door kwantitatieve Western blotting met behulp fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen en gemiddelden uitgezet om de hoeveelheid RCC2 te berekenen die nodig zijn om evenwicht te bereiken. (C ) Voorbeeld output van een experiment waarbij Rac1-bindende eiwitten binden aan elkaar en vormen een ternair complex dan concurrerende. BBP geladen Rac1 werd gemengd met 5 ui GFP-RCC2 en toenemende volumes van GFP-coronin-1C volledige lengte werden getitreerd in. De toename in gebonden GFP-coronin-1C zonder verlies van gebonden GFP-RCC2 geeft ternair complex formatie. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

This protocol describes a method for comparing the relative affinities of pairs of small GTPase-binding proteins. The key steps are the preparation of purified GTPase-binding proteins and the nucleotide loading of the GTPase. The use of GTPase-binding proteins with the same GFP tag, allows the concentrations at which similar amounts of each competitor binds to be accurately determined. The use of recombinant nucleotide-loaded GTPase allows interrogation of the binding properties of the GTPase under specific activity conditions. This step is also the most sensitive as nucleotides will both hydrolyze and detach from the GTPase if the magnesium conditions are not maintained precisely.

In the cell, the large number of GTPase-binding proteins combined with the rapid nucleotide turnover makes such pathways difficult to interpret. The simplicity of this method in comparing only pairs of binding proteins and using carefully controlled nucleotide-loading conditions allows signaling pathways to be elucidated. However, the greatest strength of the protocol is also the greatest weakness as it is a simplification of the in vivo situation. Competition assays can be used to build a robust hypothesis, but this should then be tested in cells by knockdown experiments.

There are three features that must be considered when selecting the GFP-tagged GTPase-binding proteins to be used in the experiment. First, the fusion proteins must express well in mammalian cells, such as HEK293T, as competition assays require a reasonable amount of protein. Second, it must be possible to purify the recombinant protein without significant degradation, and where this is not possible, cloning of a GTPase-binding fragment should be considered. Third, the two GTPase-binding proteins must resolve from one another on SDS-PAGE to allow analysis in section 6.

There are a number of potential caveats to the experiment that need to be considered, and possibly addressed:

Possible denaturation of purified GTPase-binding proteins during the acid elution step or steric hindrance by the GFP tag. In our hands, these have not been a problem, but must be tested. The purified proteins can be tested in functional assays ¹⁰. Commercial kits now exist for testing the activity of GEFs or GAPs without the need for isotope-labeled nucleotides. Sequestering proteins, by their nature protect GTPases from GEF or GAP activity, so can be used as competitive inhibitors in the commercial GEF or GAP assays, as we did in our recent publication ⁷. The relevant feature of proteins that traffic GTPase are the capacity to bind the GTPase, and this can be tested easily in a pull down assay. An alternative approach to testing protein integrity that is applicable to all binding proteins is to titrate protein eluted from GFP-trap beads with glycine with the same protein removed from GFP-trap beads by enzymatic cleavage. The experiment would be analyzed by probing both the GFP-tagged and cleaved protein with an antibody against the protein itself. If the protein is undamaged by elution, equilibrium should be achieved at a 1:1 ratio. This approach would also indicate whether the presence of the GFP tag itself compromises the binding properties of the candidate protein, though this does require the production of a construct with an enzymatic cleavage site between the tag and the binding protein. Whether the protein is compromised by the tag or the elution step, the problem could be addressed by modifying the protocol to use an alternative purification method. Rather than GFP, binding proteins could be His-tagged, purified using Ni-NTA and analyzed using an antibody against the His-tag. The important feature is that both binding proteins must share a common tag although, if necessary, two tags could be added to a protein, one for purification and the other for detection.

The protocol is designed to investigate competition between interactions with the switch I/II domains. Although the majority of GTPase interactions are mediated by this motif, there are some exceptions, most notably the interactions of GDIs that bind to the prenyl tail, as well as obscuring the switch domains. In principle, the protocol could be adapted to use GTPase purified from mammalian cells, so that the GTPase is prenylated, however, the presence of multiple binding sites or allosteric effects complicate the interpretation of competition-binding data. Further problems associated with such a modification are that GDIs co-purify with GTPase from mammalian cells, compromising the purity of the isolated proteins and the hydrophobic nature of the prenyl groups means that prenylated GTPases are associated with either GDI or lipid membrane and such factors would need to be considered in the experiment.

The amount of GST-Rac1 being used in the assay. The constant GTPase binding protein must be at a greater concentration than the Rac1, or when the competitor is added, it will simply bind to free Rac1. It will be immediately obvious if this has happened as binding of the competitor, without a loss of the constant protein, will be detected in much the same way as when the two competing proteins bind to one another as shown in Figure 3B. As an additional control (Step 5.3), a binding reaction containing double the amount of constant binding protein and no variable binding protein should be included (Step 5.3). If the Rac1 in the titration experiment is saturated, doubling the amount of constant binding protein will have no effect on the output. The volumes suggested in the protocol should be appropriate, but the amount of Rac1 can be easily reduced. If binding of the competitor without loss of the constant binding partner is observed, reducing the amount of Rac1 should be attempted before trying to map binding sites to avoid ternary complex formation.

Non-specific interaction of GTPase-binding proteins with the GST or bead, as well as specifically with Rac1. This problem would be manifested by residual binding of the constant GTPase-binding protein, even when the variable GTPase-binding protein has reached a plateau at high concentration. Identification of this issue will be aided by conducting reciprocal experiments where the constant and variable GTPase-binding proteins are swapped. Reciprocal experiments will also greatly improve the accuracy of the estimate of equilibrium point, so should always be included. In cases of non-specific binding, the relative concentrations at which equilibrium is achieved can still be calculated by comparing band intensity between the maxima and minima for each protein, or by measuring the extent of non-specific binding by using GST beads as bait, rather than GST-Rac1.

Pull down assays using different nucleotide-loading conditions should be used to complement the competition assay described in this protocol. Determining the nucleotide preference of partners is important for both understanding the competition events and understanding the signaling pathway that the GTPase-binding protein is involved in. In Figure 2B we analyze binding of proteins with established preference for GTP-loaded or nucleotide-free GTPase as a means to validate nucleotide loading. However, it is sensible to investigate the effect of nucleotide loading on each of the competitors as well. If the hypothetical competitors show different preferences, competition will make less of a contribution to the signaling pathway, and indeed nucleotide turnover is likely to be the mechanism that directs exchange of the binding proteins.

Materials

Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE protease inhibitor	Roche	05 056 489 001
Glutathione magnetic beads	Pierce	88821
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
Blocking Buffer	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP antibody	Living Colors	632592	Use at 1/1000 dilution
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1 antibody	Cell Signaling	2602S	Use at 1/1000 dilution
Odyssey SA Infrared Imaging System	Li-cor	9260-11PC