השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

Summary

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Abstract

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

Introduction

The actin cytoskeleton that determines the shape, polarity and migratory properties of mammalian cells is regulated by the Rho-family of small GTPases. The Rho-family GTPases include RhoA that stimulates cytoskeletal contraction, Rac1 that stimulates actin branching and membrane protrusion, and Cdc42 that has similar effects on actin polymerization to Rac1 and causes the formation of filopodia ^1,2. GTPase signaling activity is determined by binding of a nucleotide, which controls the contraction and relaxation of the switch I and switch II loops that mediate the protein-protein interactions with both regulators and effectors. Guanosine 5’-triphosphate (GTP)-bound GTPases activate downstream effectors, whereas the Guanosine 5’-diphosphate (GDP)-bound form is inactive. In the cell, cycles of GTP hydrolysis and nucleotide exchange allow rapid turnover of GTPase signals that are necessary for cytoskeletal dynamics. Nucleotide turnover is regulated by three mechanisms. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) stabilize the nucleotide-free GTPase, catalyzing exchange of GDP for GTP, and thereby stimulating GTPase signaling activity ^3,4. GTPase-activating proteins (GAPs) catalyze hydrolysis of GTP to GDP, thereby inhibiting GTPase signaling activity ⁵. Sequestering molecules such as regulator of chromatin condensation 2 (RCC2) and guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) obscure the switch loops and in the case of GDIs remove the GTPase from the membrane by interaction with the prenyl tail ^6,7. Each of the three classes of regulatory molecule interact with the switch loops, as do the downstream effectors and some trafficking regulators such as coronin-1C ⁷. The purpose of this protocol is to measure competition for the switch I/II binding site between putative regulators and downstream signaling molecules. It should be noted that competition assays test binding to a shared binding site, so that this protocol is not suitable for testing interactions with other sites, such as binding of GDIs to the prenyl tail.

The subtlety of the conformation differences between active and inactive forms, combined with the labile nature of the bound nucleotide, has made study of GTPase-binding events difficult. The role of the bound nucleotide means that conventional binding assays such as immunoprecipitation or surface plasmon resonance are not well suited to investigation, as the nucleotide cannot be controlled. This obstacle is compounded by the overlap in the binding sites of GEFs, GAPs, effectors, sequestering molecules and trafficking molecules, which make binding data for a single interaction difficult to interpret in the context of the competition that will occur in the cell. Immunoprecipitation, in particular, is compromised by competition between binding partners, as under certain cellular conditions, one binding partner might be identified at the expense of all others, while under other conditions, another partner might dominate. The dynamic nature of GTPase signaling is essential to GTPase function and must be considered when analyzing the relationships between the binding interactions of different regulators. Indeed, we recently described a pathway that relied heavily on competitive binding. We identified coronin-1C as a trafficking molecule that bound to the switch loops of GDP-Rac1 ⁷. In areas of low GEF activity, trafficking would dominate, removing Rac1 from those regions. However, when Rac1 is delivered to regions of the cell where GEF activity is high, the GEF would outcompete coronin-1C, thereby both activating Rac1 and preventing coronin-1C-mediated removal of Rac1 from that area. The model goes further, because the action of the GEF exchanges bound GDP for GTP, shifting the equilibrium still further from coronin-1C. Consequently, Rac1 activity could be explained entirely in terms of competition and relative affinity.

In this protocol, we describe a method for comparing the relative affinities of different binding partners for small GTPases, using Rac1 as an example. By using a purified protein approach, it is possible to piece together a chain of signaling events by pair wise comparison, in an experiment where the bound nucleotide can be closely controlled.

Protocol

1. טיהור של GTPase מתויג GST תרבות E. זן coli כגון BL21 הפך עם pGEX-Rac1 O / N ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 220 סל"ד, 500 מיליליטר של תקשורת autoinduction (25 מ"מ Na 2 HPO 4, 25 מ"מ KH 2 PO 4, 50 מ"מ NH 4 Cl, 5 מ"מ Na 2 SO 4, 2 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ CaCl 2, 0.5% גליצרול, גלוקוז 0.05%, 0.2% לקטוז, 5 גרם Tryptone, תמצית שמרים 2.5 גרם, 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין). חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולה חיידקים במגיבים מיצוי חלבון 20 מיליליטר, מעכבי פרוטאז 1x ודגירה של 20 דקות ב RT עם היפוך. להבהיר את lysate ידי צנטריפוגה ב40,000 XG למשך 30 דקות. להוסיף חרוזים מגנטיים 2 מיליליטר גלוטתיון, לשטוף עם פוספט שנאגרו המלוח (PBS: 10 מ"מ Na 2 HPO 4, 1.8 מ"מ KH 2 PO 4, 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl). דגירה עבור שעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף חרוזים טעונים חלבון ארבע פעמים עם 10 מיליליטר PBS, באמצעות סדרן חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב. Resuspend חלבון טעון חרוזים ב 2 מיליליטר PBS ולאחסן ב -80 ° C ב 100 aliquots μl עד צורך. 2. ביטוי של חלבונים מחייב GTPase היום לפני הניסוי, פלסמידים transfect קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -tagged גרסאות של כל חלבון קושר GTPase ל- 75 סנטימטר 2 בקבוק נפרד של HEK293T כדלקמן. לאימות של טעינת נוקלאוטיד, מתויג GFP transfect TrioD1 ל- 75 סנטימטר 2 בקבוק שלישי של HEK293T. לדלל polyethylamine עד 1 מ"ג / מיליליטר ב 100 μl סטרילי 150 מ"מ NaCl. להוסיף polyethylamine המדולל 27 μl 223 μl מופחת תקשורת בסרום. להוסיף פלסמיד דנ"א מיקרוגרם 12 עד 250 μl מופחת תקשורת בסרום. דגירה צינור אחד עבור 2 דקות ב RT. </li> מערבבים את polyethylamine וDNA מתערבב בצינור יחיד ומערבולת למשך 2 דקות. דגירה של 15-20 דקות ב RT. החלף את המדיה הצמיחה (נשר מדיה השתנה Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, L-גלוטמין 2 מ"מ, ללא אנטיביוטיקה) על 90% HEK293T מחוברות עם 5 מיליליטר תקשורת צמיחה טרי. מוסיף את תערובת polyethylamine / DNA המשולב לבקבוק ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. 3. טיהור של חלבונים מחייב GTPase יש לשטוף את צלוחיות של תאי transfected בPBS ולנקז בקבוק במשך 5 דקות, aspirating נוזל חופשי. לגרד את תאים ב500 חיץ תמוגה μl (50 מ"מ טריס-HCl (pH7.8), 1% Nonidet P-40, 1x מעכבי פרוטאז) לצינור microfuge. תאי Lyse על ידי ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך תמוגה, לשטוף שני המון חרוזים GFP-מלכודת 40 μl שלוש פעמים עם חיץ תמוגה טרי, חרוזים סדימנטציה ב2,700 XG למשך 2 דקות בין שוטף. להבהיר lysates על ידי צנטריפוגה ב21,000 XG במשך 10 דקות. העברה הבהירה lysate של כל אחד מחלבוני המתחרה להפריד חרוזים GFP-מלכודת שטפו ולאפשר חלבוני GFP-היתוך להיקשר לשעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס. שמור lysate מתאי ה- GFP-TrioD1 על קרח. לשטוף חרוזים GFP-מלכודת נטענים פעמיים ב 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.8), 50 מ"מ NaCl, 0.7% (w / v) Nonidet P-40 ופעמים ב 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2 , סדימנטציה חרוזים ב2,700 XG למשך 2 דקות בין שוטף. Elute חלבוני GFP-היתוך על ידי הוספת 40 μl 0.2 M גליצין (pH 2.5) וpipetting למעלה ולמטה במשך 30 שניות. מייד חרוזים משקעים ב21,000 XG במשך 60 של ונוזל להעביר צינור microfuge חדש המכיל 4 μl 1 M טריס- HCl (pH 10.4). לעשות את זה מהר כדי לצמצם את הפגיעה בחלבון המטוהר. לנתח 1 μl של כל חלבון מטוהר על ידי כתם מערבי ובדיקה עם נוגדן אנטי GFP להקים תשואה היחסית באמצעות blott כמותייםing מערכת על פי הפרוטוקול של היצרן. לחלופין, לקבוע ריכוזי חלבון על ידי חומצת assay bicinchoninic (BCA), אבל זה מציג שגיאות אם החלבונים לא מגיבים עם assay באופן זהה או יש חלבונים מזהמים. להשוות ריכוז חלבון טוחנת על ידי התוספת של 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2. 4. טעינת נוקלאוטיד של GTPase להפשיר aliquot אחד חרוזים מגנטיים GST-Rac1, מוכנים בשלב 1. קח 90 μl של חרוזים GST-Rac1 ולשטוף שלוש פעמים עם 20 מ"מ טריס- HCl (pH 7.6), 25 מ"מ NaCl, 0.1 מ"מ DTT, 4 מ"מ EDTA, באמצעות סדרן חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב. מאגר לשאוב מחרוזים ולהוסיף 100 μl 20 מ"מ טריס- HCl (pH 7.6), 25 מ"מ NaCl, 0.1 מ"מ DTT, 4 מ"מ EDTA. לדברי האם התמ"ג, GTP או לא טעינת נוקלאוטיד נדרש לניסוי התחרות, להוסיף 12 μl 100 מ"מ תמ"ג, μl 12 10 מ"מ ג.א.anosine 5 '- [γ-thio] אדנוזין (GTPγS) או לא נוקלאוטיד לחרוזי GST-Rac1 60 μl. לבקרות נוקלאוטיד-הטעינה, לפצל את חרוזים שנותרו לשלושה aliquots 10-μl ולהוסיף 2 μl 100 מ"מ תמ"ג, 2 μl 10 מ"מ GTPγS או לא נוקלאוטיד על צינור אחד. דגירה תערובות חרוז למשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה. לייצב Rac1 מאוגד נוקלאוטיד על ידי תוספת של 1 M MgCl 2: 3 μl לתערובת הניסיונית (שלב 4.4), 0.5 μl לכל אחד מתערובות השליטה (שלב 4.5). 5. תחרות המחייבת. הגדרה 6 צינורות microfuge, המכיל: 200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2 חרוזים 10 μl ניסיוניים טעון נוקלאוטיד Rac1 (משלב 4.7) חלבון 5 μl Rac1 מחייב (חלבון מחייב קבוע) על צינור אחד, להוסיף חלבון B 0, 1, 2.5, 5, 10 או 20 μl מחייב Rac1 (חלבון מחייב משתנה). כרכים אלה מניחיםpproximately ריכוזי המניה שווים של חלבונים המחייבים קבועים ומשתנים וייתכן שיצטרכו להיות מותאמים. התאם כרכים של חלבונים מחייבים A ו- B אם יש הבדלים גדולים בזיקות המחייבות של שני חלבונים ואת זה צריך להיקבע באופן אמפירי באמצעות החזרות הניסיוניות. מרכיבים את הנפח הכולל של התערובת מחייב 235 μl על ידי תוספת של 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2. הגדר את צינור microfuge המכיל: 200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2 חרוזים 10 μl ניסיוניים טעון נוקלאוטיד Rac1 (משלב 4.7) חלבון 10 μl Rac1 מחייב (חלבון מחייב קבוע) הגדרת התמ"ג, GTPγS ולא צינורות שליטת נוקלאוטיד: 200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2 10 חרוזים Rac1 שליטת μl נטענים בשלב 4.5 עם תוצר, GTPγS או לא נוקלאוטיד והתייצבו בשלב 4.7. 180 μl Hlysate EK293T GFP-TrioD1, מוכן כמו בשלב 3.6 4 μl 1 M MgCl 2 דגירה את התערובת לשעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2. Elute מחויב חלבונים בμl 20 הפחתת חיץ מדגם (50 מ"מ טריס-HCl (pH 7), 5% SDS, גליצרול 20%, 0.02 מ"ג / מיליליטר bromophenol, 5% β-mercaptoethanol הכחול). 6. ניתוח של תחרות לפתור 10 μl של החלבון הקשור (שלב 5.6) על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE) וכתם מערבי. דגירה הקרום על 4 מעלות CO / N מדולל 1/1000 בנוגדן אנטי-GFP בחסימת המאגר מדולל ל1x PBS, 0.1% Tween-20 לזהות שניהם מחייב חלבוני GTPase מתויגים. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS, 0.1% Tween-20. דגירה הממברנה במשך 30 דקות ב RT בDyLight שניות נגד ארנב 800 מצומדות-נוגדן ondary, בדילול מלא 1 / 10,000 בחסימת המאגר מדולל ל1x PBS, Tween-20 0.1%. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS, 0.1% Tween-20. סרוק את הקרום באמצעות מערכת הדמיה אינפרא אדום, שימוש בתוכנה למדידת עוצמת להקה על פי הפרוטוקול של היצרן. עלילה עוצמת הלהקה של כל חלבון נגד נפח של המתחרה משתנה (חלבון B). מחלקים את הנפח של מתחרה משתנה בנקודה שבה הקווים מצטלבים בנפח של מתחרה קבועה (חלבון, 5 μl) כדי לקבוע את יחס המתחרה שבשיווי המשקל מושגת. לאימות מעמד נוקלאוטיד-טעינה, קרומי בדיקה לקינאז מופעל p21 1 (PAK1) (מפעיל) וה- GFP-TrioD1 (GEF), כמתואר בצעדים 6.1-6.6.

Representative Results

פרוטוקול זה נועד לחשב את הזיקות היחסית של שותפים מחייבים Rac1, ללא הצורך לדעת את הריכוז המדויק של המתחרים (איור 1). קביעת ריכוז חלבון מציגה שגיאות וכאשר בוחנת את תחרות בין מולקולות במסלול איתות אינו נחוצה. עם זאת, חשוב לדעת כי יש שני מתחרים באותו ריכוז טוחנת בפתרונות המניות כדי לאפשר יחסים פשוטים שיחושבו בעת הוספת נפחים שונים לassay. יש לי 40 μl של חרוזים GFP-מלכודת יכולת מחייבת של ~ 300 pmol כך מחוברות 75 סנטימטר 2 צלוחיות של מאוד לבטא בתאים יהיה להרוות את חרוזים, והתוצאה הוא שההכנות של שני חלבונים מחייבים השונים תהיה דומות לפני ההתאמה (איור 2 א). אם אחד מהחלבונים מבטא בצורה גרועה, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי טיהור חלבון שמן בקבוק אחד או יותר של תאים. <p class = "jove_content"> המחייב של רוב effectors GTPase ורגולטורים תלוי בנוקלאוטיד-הטעינה של GTPase הפיתיון, ולכן חשוב לבדוק אם הטעינה הייתה מוצלחת. טעינה יכולה להיות מאומת על ידי מזרז חלבונים מחייבים ידועים מlysates התא. חלבוני מפעיל, כגון לאגד PAK1 לGTP-Rac1 וניתן זירז בקלות מlysates וזוהו על ידי מערבי סופג 8 (איור 2). GEFs להיקשר מעדיף לנוקלאוטיד ללא GTPase לייצב את מצב המעבר. כGEFs הוא של שפע נמוך, בדרך כלל לא פעיל ולעתים קרובות למחוק גרוע, עדיף לביטוי יתר GEF או בר GEF לGTPase ללא נוקלאוטיד מבחן. אנו משתמשים לעתים קרובות ההומולוגיה, הזוגית הראשונה של שלישייה, הביע כהיתוך GFP (GFP-TrioD1 9) (איור 2), אך כל GEF יעבוד. חלבונים שנקשרים לGTPase טעון התמ"ג הם נדירים יותר. לאחרונה דיווחו RCC2 כחלבון אחד כזה 7, או תמ"ג טעינה יכולה להיות מאומת פשוט כמו בינדיng ללא GEF ולא מפעיל. הפלט מהניסוי יהיה כתם מערבי המתאר את שני שותפים מחייבים מתויג GFP חייבים GTPase. על ידי שימוש בנוגדנים חד לזהות שני החלבונים, ניתן לקבוע את הריכוזים שבי כמויות דומות של שני המתחרים לאגד ולכן הזיקות יחסי להסיק. בדוגמא זו תחרות בין תחום המדחף של חלבון Rac1-הסחר, coronin-1C (Rac1 מחייב חלבון), וחלבון Rac1-sequestering, RCC2 (Rac1 מחייב חלבון B), הוא הוכיחו (איור 3 א). על ידי שימוש בנפח קבוע של מדחף coronin-1C (5 μl), והוספת כמויות הולכות וגדל של RCC2, אנו יכולים לראות מGFP למחוק הוא הגיע לשיווי המשקל שב1.25-2.5 μl של RCC2 (כוכבית), הוכחה כי RCC2 יש חזק זיקה לRac1 מ coronin-1C. על ידי מדידת עוצמת להקות באמצעות מערבי סופג כמותי, וזומם ערכים ממוצע לכל competitor, נקודת שיווי המשקל יכולה להיות מחושבת בצורה מדויקת על ידי זיהוי הכרכים שבעקומות מצטלבות (איור 3). אחד המכשולים האפשריים לassay תחרות מוצלח הוא אם השותפים מחייבים לקשור זה לזה, כמו גם מחייב Rac1. ב+ 3 א B איור אנחנו מדגימים תחרות בין RCC2 ותחום המדחף של coronin-1C, ולא coronin-1C באורך מלא. הסיבה לשימוש בcoronin הקטוע היא שcoronin-1C גם נקשר RCC2 דרך תחום הזנב. כאשר אורך מלא coronin-1C הוא טיטרציה נגד RCC2, כריכה של שני החלבונים מזוהה, עקב היווצרות משולשת מורכבת, ולא תחרות (איור 3 ג). אם תחרות מתרחשת, הכריכה של חלבון אחד תגדל ואילו ירידות האחרות, וסך מחויב GFP-ההיתוך יישאר קבוע. במקרים בהם מורכב משולש יוצר יש צורך לחתוך אחד של החלבון קושר GTPase כך שcompetitors אינטראקציה כבר לא. איור 1. זרימת עבודה. ייצוג סכמטי של זרימת העבודה לקביעת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. אימות של חלבונים מטוהרים. () מטוהרים Rac1 מחייב חלבונים נותחו על ידי כתם מערבי, חיטוט באנטי-GFP כדי לקבוע את התשואה היחסית של שני החלבונים מתויג GFP. סוג זה של השוואה במהלך הניסוי מאפשר הריכוז של שני החלבונים להיות מותאם כך שיתאימו בניסוי המחייב. (ב) GDP, GTPγS ולא GST-Rac1 טעון נוקלאוטיד הודגר עם lysate מHEK293T להביע GFP-TrioD1 ומחויב חלבונים זוהו על ידי קשירת קשר לPAK1 אנדוגני או ביטוי יתר GFP-TrioD1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. ניתוח כתם מערבי של חלבון ביחס מחייב. תפוקות דוגמא ממבחנים מחייב תחרות. טעון תמ"ג () Rac1 היה מעורב עם תחום מדחף 5 μl GFP-coronin-1C והגדלת נפחים של ה- GFP-RCC2 היו טיטרציה ב. ב חלבונים קשורים מערבי סופג לGFP, נושאים עם זיהוי ההפרש של שני החלבונים הם נמנעו ואות ה- GFP מדווחת יחס טוחנת בין שני חלבוני האיחוי. כוכביות לציין את יחסי תחרות על eitheצד r של נקודת שיווי המשקל. (ב) בעוצמות בנד של חלבוני היתוך GFP קשורים משלושה ניסויים בלתי תלויים נמדדו על ידי מערבי סופג כמותי, באמצעות נוגדנים משניים fluorophore מצומדות וממוצעים זממו כדי לחשב את הסכום של RCC2 הדרושים כדי להגיע לשיווי משקל. (C ) פלט דוגמא מניסוי שבו חלבוני Rac1 מחייבים להיקשר זה לזה ויוצרים מורכב משולש, ולא מתחרה. Rac1 היה מעורב עם GFP-RCC2 5 μl והגדלת נפחים של ה- GFP-coronin-1C באורך מלא טעון תמ"ג היה טיטרציה ב. הגידול בGFP-coronin-1C כבול ללא אובדן של ה- GFP-RCC2 כבול מציינת היווצרות מורכבת משולשת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

This protocol describes a method for comparing the relative affinities of pairs of small GTPase-binding proteins. The key steps are the preparation of purified GTPase-binding proteins and the nucleotide loading of the GTPase. The use of GTPase-binding proteins with the same GFP tag, allows the concentrations at which similar amounts of each competitor binds to be accurately determined. The use of recombinant nucleotide-loaded GTPase allows interrogation of the binding properties of the GTPase under specific activity conditions. This step is also the most sensitive as nucleotides will both hydrolyze and detach from the GTPase if the magnesium conditions are not maintained precisely.

In the cell, the large number of GTPase-binding proteins combined with the rapid nucleotide turnover makes such pathways difficult to interpret. The simplicity of this method in comparing only pairs of binding proteins and using carefully controlled nucleotide-loading conditions allows signaling pathways to be elucidated. However, the greatest strength of the protocol is also the greatest weakness as it is a simplification of the in vivo situation. Competition assays can be used to build a robust hypothesis, but this should then be tested in cells by knockdown experiments.

There are three features that must be considered when selecting the GFP-tagged GTPase-binding proteins to be used in the experiment. First, the fusion proteins must express well in mammalian cells, such as HEK293T, as competition assays require a reasonable amount of protein. Second, it must be possible to purify the recombinant protein without significant degradation, and where this is not possible, cloning of a GTPase-binding fragment should be considered. Third, the two GTPase-binding proteins must resolve from one another on SDS-PAGE to allow analysis in section 6.

There are a number of potential caveats to the experiment that need to be considered, and possibly addressed:

Possible denaturation of purified GTPase-binding proteins during the acid elution step or steric hindrance by the GFP tag. In our hands, these have not been a problem, but must be tested. The purified proteins can be tested in functional assays ¹⁰. Commercial kits now exist for testing the activity of GEFs or GAPs without the need for isotope-labeled nucleotides. Sequestering proteins, by their nature protect GTPases from GEF or GAP activity, so can be used as competitive inhibitors in the commercial GEF or GAP assays, as we did in our recent publication ⁷. The relevant feature of proteins that traffic GTPase are the capacity to bind the GTPase, and this can be tested easily in a pull down assay. An alternative approach to testing protein integrity that is applicable to all binding proteins is to titrate protein eluted from GFP-trap beads with glycine with the same protein removed from GFP-trap beads by enzymatic cleavage. The experiment would be analyzed by probing both the GFP-tagged and cleaved protein with an antibody against the protein itself. If the protein is undamaged by elution, equilibrium should be achieved at a 1:1 ratio. This approach would also indicate whether the presence of the GFP tag itself compromises the binding properties of the candidate protein, though this does require the production of a construct with an enzymatic cleavage site between the tag and the binding protein. Whether the protein is compromised by the tag or the elution step, the problem could be addressed by modifying the protocol to use an alternative purification method. Rather than GFP, binding proteins could be His-tagged, purified using Ni-NTA and analyzed using an antibody against the His-tag. The important feature is that both binding proteins must share a common tag although, if necessary, two tags could be added to a protein, one for purification and the other for detection.

The protocol is designed to investigate competition between interactions with the switch I/II domains. Although the majority of GTPase interactions are mediated by this motif, there are some exceptions, most notably the interactions of GDIs that bind to the prenyl tail, as well as obscuring the switch domains. In principle, the protocol could be adapted to use GTPase purified from mammalian cells, so that the GTPase is prenylated, however, the presence of multiple binding sites or allosteric effects complicate the interpretation of competition-binding data. Further problems associated with such a modification are that GDIs co-purify with GTPase from mammalian cells, compromising the purity of the isolated proteins and the hydrophobic nature of the prenyl groups means that prenylated GTPases are associated with either GDI or lipid membrane and such factors would need to be considered in the experiment.

The amount of GST-Rac1 being used in the assay. The constant GTPase binding protein must be at a greater concentration than the Rac1, or when the competitor is added, it will simply bind to free Rac1. It will be immediately obvious if this has happened as binding of the competitor, without a loss of the constant protein, will be detected in much the same way as when the two competing proteins bind to one another as shown in Figure 3B. As an additional control (Step 5.3), a binding reaction containing double the amount of constant binding protein and no variable binding protein should be included (Step 5.3). If the Rac1 in the titration experiment is saturated, doubling the amount of constant binding protein will have no effect on the output. The volumes suggested in the protocol should be appropriate, but the amount of Rac1 can be easily reduced. If binding of the competitor without loss of the constant binding partner is observed, reducing the amount of Rac1 should be attempted before trying to map binding sites to avoid ternary complex formation.

Non-specific interaction of GTPase-binding proteins with the GST or bead, as well as specifically with Rac1. This problem would be manifested by residual binding of the constant GTPase-binding protein, even when the variable GTPase-binding protein has reached a plateau at high concentration. Identification of this issue will be aided by conducting reciprocal experiments where the constant and variable GTPase-binding proteins are swapped. Reciprocal experiments will also greatly improve the accuracy of the estimate of equilibrium point, so should always be included. In cases of non-specific binding, the relative concentrations at which equilibrium is achieved can still be calculated by comparing band intensity between the maxima and minima for each protein, or by measuring the extent of non-specific binding by using GST beads as bait, rather than GST-Rac1.

Pull down assays using different nucleotide-loading conditions should be used to complement the competition assay described in this protocol. Determining the nucleotide preference of partners is important for both understanding the competition events and understanding the signaling pathway that the GTPase-binding protein is involved in. In Figure 2B we analyze binding of proteins with established preference for GTP-loaded or nucleotide-free GTPase as a means to validate nucleotide loading. However, it is sensible to investigate the effect of nucleotide loading on each of the competitors as well. If the hypothetical competitors show different preferences, competition will make less of a contribution to the signaling pathway, and indeed nucleotide turnover is likely to be the mechanism that directs exchange of the binding proteins.

Materials

Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE protease inhibitor	Roche	05 056 489 001
Glutathione magnetic beads	Pierce	88821
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
Blocking Buffer	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP antibody	Living Colors	632592	Use at 1/1000 dilution
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1 antibody	Cell Signaling	2602S	Use at 1/1000 dilution
Odyssey SA Infrared Imaging System	Li-cor	9260-11PC