Jämföra Affinity av GTPas-bindande proteiner med hjälp av konkurrensanalyser

Summary

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Abstract

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

Introduction

The actin cytoskeleton that determines the shape, polarity and migratory properties of mammalian cells is regulated by the Rho-family of small GTPases. The Rho-family GTPases include RhoA that stimulates cytoskeletal contraction, Rac1 that stimulates actin branching and membrane protrusion, and Cdc42 that has similar effects on actin polymerization to Rac1 and causes the formation of filopodia ^1,2. GTPase signaling activity is determined by binding of a nucleotide, which controls the contraction and relaxation of the switch I and switch II loops that mediate the protein-protein interactions with both regulators and effectors. Guanosine 5’-triphosphate (GTP)-bound GTPases activate downstream effectors, whereas the Guanosine 5’-diphosphate (GDP)-bound form is inactive. In the cell, cycles of GTP hydrolysis and nucleotide exchange allow rapid turnover of GTPase signals that are necessary for cytoskeletal dynamics. Nucleotide turnover is regulated by three mechanisms. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) stabilize the nucleotide-free GTPase, catalyzing exchange of GDP for GTP, and thereby stimulating GTPase signaling activity ^3,4. GTPase-activating proteins (GAPs) catalyze hydrolysis of GTP to GDP, thereby inhibiting GTPase signaling activity ⁵. Sequestering molecules such as regulator of chromatin condensation 2 (RCC2) and guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) obscure the switch loops and in the case of GDIs remove the GTPase from the membrane by interaction with the prenyl tail ^6,7. Each of the three classes of regulatory molecule interact with the switch loops, as do the downstream effectors and some trafficking regulators such as coronin-1C ⁷. The purpose of this protocol is to measure competition for the switch I/II binding site between putative regulators and downstream signaling molecules. It should be noted that competition assays test binding to a shared binding site, so that this protocol is not suitable for testing interactions with other sites, such as binding of GDIs to the prenyl tail.

The subtlety of the conformation differences between active and inactive forms, combined with the labile nature of the bound nucleotide, has made study of GTPase-binding events difficult. The role of the bound nucleotide means that conventional binding assays such as immunoprecipitation or surface plasmon resonance are not well suited to investigation, as the nucleotide cannot be controlled. This obstacle is compounded by the overlap in the binding sites of GEFs, GAPs, effectors, sequestering molecules and trafficking molecules, which make binding data for a single interaction difficult to interpret in the context of the competition that will occur in the cell. Immunoprecipitation, in particular, is compromised by competition between binding partners, as under certain cellular conditions, one binding partner might be identified at the expense of all others, while under other conditions, another partner might dominate. The dynamic nature of GTPase signaling is essential to GTPase function and must be considered when analyzing the relationships between the binding interactions of different regulators. Indeed, we recently described a pathway that relied heavily on competitive binding. We identified coronin-1C as a trafficking molecule that bound to the switch loops of GDP-Rac1 ⁷. In areas of low GEF activity, trafficking would dominate, removing Rac1 from those regions. However, when Rac1 is delivered to regions of the cell where GEF activity is high, the GEF would outcompete coronin-1C, thereby both activating Rac1 and preventing coronin-1C-mediated removal of Rac1 from that area. The model goes further, because the action of the GEF exchanges bound GDP for GTP, shifting the equilibrium still further from coronin-1C. Consequently, Rac1 activity could be explained entirely in terms of competition and relative affinity.

In this protocol, we describe a method for comparing the relative affinities of different binding partners for small GTPases, using Rac1 as an example. By using a purified protein approach, it is possible to piece together a chain of signaling events by pair wise comparison, in an experiment where the bound nucleotide can be closely controlled.

Protocol

1. Rening av GST-märkt GTPas Kultur en E. coli-stam såsom BL21 transformerad med pGEX-RAC1 O / N vid 37 ° C under skakning med 220 varv per minut, i 500 ml autoinduktion media (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH4CI, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl2, 0,5% glycerol, 0,05% glukos, 0,2% Laktos, 5 g trypton, 2,5 g jästextrakt, 100 ^ g / ml ampicillin). Harvest bakterier genom centrifugering under 10 min vid 10000 xg, 4 ° C. Resuspendera bakteriell pelleten i 20 ml proteinextraktion reagens, 1x proteasinhibitor och inkubera i 20 minuter vid RT med inversion. Klargöra lysatet genom centrifugering vid 40 tusen xg i 30 minuter. Lägg 2 ml glutation magnetiska pärlor, tvättades med fosfatbuffrad saltlösning (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI). Inkubera i 2 h, blandning genom inversion vid 4 ° C. Tvätta protein pärlor fyllda fyra gånger med 10 ml PBS, med användning av en magnetisk partikelsorterare för att fälla ut pärlorna vid varje steg. Resuspendera proteinladdade pärlor i 2 ml PBS och lagra vid -80 ° C i 100 | il alikvoter tills det behövs. 2. Expression av GTPas-bindande proteiner Dagen före försöket, transfektera plasmider kodande grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt versioner av varje GTPas-bindande protein till en separat 75-cm 2 kolv med HEK293T enligt följande. För validering av nukleotid lastning, transfektera GFP-märkta TrioD1 i en tredje 75-cm 2 kolv HEK293T. Späd polyethylamine till 1 mg / ml i 100 ul steril 150 mM NaCI. Lägg 27 pl utspädd polyethylamine till 223 pl minskade serum media. Lägg 12 ug plasmid-DNA till 250 pl minskade serum media. Inkubera varje rör för 2 min vid rumstemperatur. </li> Kombinera polyethylamine och DNA blandar i ett enda rör och vortexblanda i 2 minuter. Inkubera under 15-20 min vid RT. Ersätt tillväxtmediet (Dulbeccos modifierade Eagles media, 10% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, inga antibiotika) på 90% konfluenta HEK293T med 5 ml färskt tillväxtmedium. Lägg den kombinerade polyethylamine / DNA-blandningen till kolven och inkubera O / N vid 37 ° C, 5% CO2. 3. Rening av GTPas-bindande proteiner Skölj kolvar med transfekterade celler i PBS och dränera kolv under 5 minuter, aspire fri vätska. Skrapa av celler i 500 | il lysbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1 x proteasinhibitor) i mikrofugrör. Lyse cellerna genom att blanda genom inversion vid 4 ° C under 30 minuter. Under lys, tvätta två massor av 40 pl GFP-Trap pärlor tre gånger med färsk lysbuffert, sedimente pärlor vid 2700 xg under 2 min mellan tvättar. Klargöra lysaten genom centrifugering vid 21 tusen xg i 10 min. Överföring klar lysat av vart och ett av de konkurrerande proteiner för att separera tvättade GFP-fälla pärlor och tillåter GFP-fusionsproteiner att binda under 2 h, blanda genom inversion vid 4 ° C. Håll lysat från GFP-TrioD1 celler på is. Tvätta laddade GFP-Trap pärlorna två gånger i 50 mM tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCI, 0,7% (vikt / volym) Nonidet P-40 och två gånger i 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 , sedimente pärlor vid 2700 xg under 2 minuter mellan tvättar. Eluera GFP-fusionsproteiner genom tillsats av 40 pl 0,2 M glycin (pH 2,5) och pipettera upp och ned under 30 sekunder. Omedelbart sediment pärlor vid 21 tusen xg under 60 s och överföringsvätska till en ny mikrofugrör innehållande 4 | j, l 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Gör detta snabbt att begränsa skadorna på det renade proteinet. Analysera 1 | il av varje renat protein genom Western blöt och sond med en anti-GFP-antikropp för att fastställa relativ utbyte med användning av en kvantitativ blotting system enligt tillverkarens protokoll. Alternativt, bestämmer proteinkoncentrationer av bicinkoninsyra (BCA) analys men detta introducerar fel om proteinerna inte reagerar med analysen på ett identiskt sätt eller om det finns kontaminerande proteiner. Utjämna molära proteinkoncentrationen genom tillsats av 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2. 4. Nukleotid lastning av GTPas Tina en alikvot av GST-RAC1 magnetiska pärlor, som framställts i steg 1. Ta 90 | il GST-RAC1 pärlorna och tvätta tre gånger med 20 mM tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, med användning av en magnetisk partikelsorterare för att fälla ut pärlorna vid varje steg. Aspirera buffert från pärlor och tillsätt 100 | il 20 mM tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA. Beroende på om BNP GTP eller ingen nukleotid lastning krävs för tävlingen experimentet, tillsätt 12 pl 100 mM BNP, 12 pl 10 mM guanosine 5 '- [γ-tio] trifosfat (GTPyS) eller ingen nukleotid till 60 pl GST-RAC1 pärlor. För nukleotid-belastningskontroller, dela de återstående kulorna i tre 10-l alikvoter och tillsätt 2 pl 100 mM BNP, 2 | il 10 mM GTPyS eller ingen nukleotid till varje rör. Inkubera bead Blandningar 30 min vid 30 ° C under omröring. Stabilisera nukleotid bundna RAC1 genom tillsats av 1 M MgCl2: 3 ul till experimentell blandning (steg 4,4), 0,5 mikroliter till varje kontrollpunkt blandningar (steg 4,5). 5. Konkurrens bindande. Ställ upp 6 mikrofugrör, vardera innehållande: 200 | il 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 10 il experimentella nukleotid belastade RAC1 pärlor (från steg 4,7) 5 pl RAC1 bindande protein A (konstant bindande protein) Till varje rör till 0, 1, 2,5, 5, 10 eller 20 | il RAC1-bindande protein B (variabel bindande protein). Dessa volymer antaga enpproximately lika stock koncentrationer av de konstanta och variabla bindande proteiner och kan behöva justeras. Justera volymer bindande proteiner A och B om det finns stora skillnader i bindningsaffiniteter av de två proteinerna och detta bör bestämmas empiriskt genom experimentella upprepningarna. Fyll på den totala volymen av bindningsblandningen till 235 ^ il genom tillsats av 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2. Inrätta ett mikrofugrör innehåller: 200 | il 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 10 il experimentella nukleotid belastade RAC1 pärlor (från steg 4,7) 10 pl RAC1 bindande protein A (konstant bindande protein) Konfigurera BNP GTPyS och ingen nukleotid kontrollrören: 200 | il 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 10 il kontroll RAC1 pärlor laddade i steg 4,5 med BNP, GTPyS eller ingen nukleotid och stabiliseras i steg 4.7. 180 | j, l HEK293T GFP-TrioD1 lysat, framställd som i steg 3,6 4 | il 1 M MgCl2 Inkubera blandningen under 2 h, blandning genom inversion vid 4 ° C. Tvätta pärlorna tre gånger med 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2. Eluera Bundna proteiner i 20 ^ reducerande provbuffert (50 mM tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glycerol, 0,02 mg / ml bromfenolblått, 5% β-merkaptoetanol). 6. Analys av konkurrens Lösa 10 | il av det bundna proteinet (steg 5,6) genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och Western blöt. Inkubera membranet vid 4 ° CO / N anti-GFP-antikropp utspädd 1/1000 i blockeringsbuffert späddes till 1x i PBS, 0,1% Tween-20 för att detektera båda de märkta GTPas-bindande proteiner. Tvätta membranet tre gånger under 10 min med PBS, 0,1% Tween-20. Inkubera membranet under 30 min vid RT i DyLight 800-konjugerad anti-kanin-sekhands antikropp, utspädd 1 / 10.000 i blockeringsbuffert späddes till 1x i PBS, 0,1% Tween-20. Tvätta membranet tre gånger under 10 min med PBS, 0,1% Tween-20. Skanna membranet med hjälp av en infraröd avbildningssystem, med hjälp av programvaran för att mäta bandintensitet enligt tillverkarens protokoll. Rita bandet intensiteten hos varje protein mot volym av den rörliga konkurrent (Protein B). Dividera volymen variabel konkurrent vid den punkt vid vilken linjerna skär varandra med volymen av konstant konkurrent (Protein A, 5 | j, l) för att bestämma den tävlande förhållandet vid vilken jämvikt uppnås. För validering av nukleotid-laddningsstatus, sondmembran för p21-aktiverat kinas 1 (Pak1) (ett effektor) och GFP-TrioD1 (a GEF), som beskrivs i steg 6.1-6.6.

Representative Results

Detta protokoll är utformad för att beräkna de relativa affiniteterna hos bindningspartner för RAC1, utan att behöva känna till exakt koncentration av konkurrenterna (Figur 1). Fastställande av proteinkoncentration introducerar fel och behövs inte när man överväger konkurrensen mellan molekyler i en signalväg. Det är dock viktigt att veta att de två konkurrenter har samma molkoncentration i lagerlösningar för att möjliggöra enkla förhållanden beräknas när du lägger till olika volymer till analysen. 40 fil GFP-Trap pärlor har en bindningskapacitet på ~ 300 pmol så en sammanhängande 75 cm 2 flaskor med mycket uttryckande celler kommer att mätta pärlorna, vilket resulterar i att förberedelserna för de två olika bindningsproteiner kommer att likna före justering (Figur 2A). Om ett av proteinerna uttrycker dåligt kan detta problem övervinnas genom att rena detta protein från mer än en kolv med celler. <p class = "jove_content"> Bindningen av de flesta GTPas effektorer och regulatorer beror på nukleotid-lastning av betet GTPas, så det är viktigt att testa huruvida lastningen har varit framgångsrik. Loading kan verifieras genom utfällning kända bindningsproteiner från cellysat. Effektorceller proteiner, såsom Pak1 binder till GTP-RAC1 och kan lätt utfällas från lysat och detekteras genom Western blotting 8 (figur 2B). GEFs binder företrädesvis till nukleotid fritt GTPas att stabilisera övergångstillståndet. Som GEFs har låg förekomst, vanligen inaktiv och ofta blot dåligt, är det bättre att överuttrycka en GEF eller GEF fragmentet till prov nukleotid fria GTPas. Vi använder ofta den första Dbl homologin i Trio, uttryckt som en GFP fusions (GFP-TrioD1 9) (figur 2B) men något GEF skulle fungera. Proteiner som binder till BNP belastade GTPase är ovanligare. Vi rapporterade nyligen RCC2 som ett sådant protein 7, eller BNP-lastning kan valideras helt enkelt som Binding varken GEF eller effektor. Utsignalen från experimentet kommer att vara en Western blöt som visar de två GFP-märkta bindningspartners bundna till GTPas. Genom att använda en enda antikropp för att detektera båda proteinerna, kan de koncentrationer vid vilka liknande mängder av både konkurrenter binder bestämmas och därför relativa affinitet sluta. I detta exempel konkurrens mellan propellerdomänen av RAC1-trafficking protein, coronin-1C (RAC1-bindande protein A) och den RAC1-sekvestrerande protein, RCC2 (RAC1-bindande protein B), påvisas (figur 3A). Genom att använda en konstant volym av coronin-1C propeller (5 pl), och tillsats av ökande volymer av RCC2, kan vi se från GFP blot att jämvikt uppnås vid 1,25-2,5 il RCC2 (asterisk), vilket visar att RCC2 har en starkare affinitet för RAC1 än coronin-1C. Genom att mäta intensiteten hos banden med användning av kvantitativ Western blotting, och plottning genomsnittsvärden för varje competitor, kan jämviktspunkten beräknas noggrant genom att identifiera de volymer där kurvorna skär (Figur 3B). En av de möjliga hinder för en framgångsrik konkurrensanalys är om bindningspartners binda till varandra samt bindning till RAC1. I fig 3A + B visar vi konkurrens mellan RCC2 och propellern domänen av coronin-1C, snarare än full längd coronin-1C. Skälet till att använda den stympade coronin är att coronin-1C binder även RCC2 genom svansdomän. När fullängds coronin-1C titreras mot RCC2, bindning av båda proteinerna detekteras, på grund av temärt komplex bildning, snarare än konkurrens (fig 3C). Om konkurrensen sker, kommer bindning av ett protein ökar medan den andra minskar, och den totala bundna GFP-fusion kommer att förbli konstant. I de fall då ett ternärt komplex bildas är det nödvändigt att trunkera en av GTPas-bindande proteinet så att konkurnärer inte längre samverkar. Figur 1. Arbetsflöde. Schematisk bild av arbetsflödet för att bestämma affiniteten hos GTPas-bindande proteiner med hjälp av konkurrensanalyser. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra. Figur 2. Validering av renade proteiner. (A) Renat GFP-märkta RAC1 bindande proteiner analyserades genom Western blöt, sondering med anti-GFP-att bestämma den relativa utbytet av de två proteinerna. Denna typ av utjämning under experimentet tillåter koncentrationen av de två proteiner som skall justeras så att de matchar i bindningsexperiment. (B) GDP, GTPyS och ingen nukleotid belastad GST-RAC1 inkuberades med lysat från HEK293T uttrycker GFP-TrioD1 och bundna proteiner detekteras genom att avsätta för endogen Pak1 eller överuttryckt GFP-TrioD1. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3. Western blot-analys av relativ proteinbindning. Exempel utgångar från konkurrensbindningsanalyser. (A) BNP-laddad RAC1 blandades med 5 pl GFP-coronin-1C propeller domän och ökande volymer av GFP-RCC2 titrerades i. Genom Western blotting bundna proteiner för GFP, är problem med differentiell detektering av de två proteinerna undvikas och GFP-signal rapporterar det molära förhållandet mellan de två fusionsproteinerna. Asterisker indikerar konkurrensförhållandena på either sidan av jämviktspunkten. (B) bandintensiteter av bundna GFP fusionsproteiner från tre oberoende experiment mättes genom kvantitativ Western blotting med användning av fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar och medelvärden ritas för att beräkna mängden RCC2 behövs för att nå jämvikt. (C ) Exempel som matas ut från ett experiment där RAC1-bindande proteiner binder till varandra och bildar ett ternärt komplex, stället för att konkurrera. BNP-laddad RAC1 blandades med 5 pl GFP-RCC2 och ökande volymer av GFP-coronin-1C fullängds titrerades i. Ökningen i bunden GFP-coronin-1C utan förlust av bundet GFP-RCC2 indikerar ternära komplexbildning. Vänligen Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

This protocol describes a method for comparing the relative affinities of pairs of small GTPase-binding proteins. The key steps are the preparation of purified GTPase-binding proteins and the nucleotide loading of the GTPase. The use of GTPase-binding proteins with the same GFP tag, allows the concentrations at which similar amounts of each competitor binds to be accurately determined. The use of recombinant nucleotide-loaded GTPase allows interrogation of the binding properties of the GTPase under specific activity conditions. This step is also the most sensitive as nucleotides will both hydrolyze and detach from the GTPase if the magnesium conditions are not maintained precisely.

In the cell, the large number of GTPase-binding proteins combined with the rapid nucleotide turnover makes such pathways difficult to interpret. The simplicity of this method in comparing only pairs of binding proteins and using carefully controlled nucleotide-loading conditions allows signaling pathways to be elucidated. However, the greatest strength of the protocol is also the greatest weakness as it is a simplification of the in vivo situation. Competition assays can be used to build a robust hypothesis, but this should then be tested in cells by knockdown experiments.

There are three features that must be considered when selecting the GFP-tagged GTPase-binding proteins to be used in the experiment. First, the fusion proteins must express well in mammalian cells, such as HEK293T, as competition assays require a reasonable amount of protein. Second, it must be possible to purify the recombinant protein without significant degradation, and where this is not possible, cloning of a GTPase-binding fragment should be considered. Third, the two GTPase-binding proteins must resolve from one another on SDS-PAGE to allow analysis in section 6.

There are a number of potential caveats to the experiment that need to be considered, and possibly addressed:

Possible denaturation of purified GTPase-binding proteins during the acid elution step or steric hindrance by the GFP tag. In our hands, these have not been a problem, but must be tested. The purified proteins can be tested in functional assays ¹⁰. Commercial kits now exist for testing the activity of GEFs or GAPs without the need for isotope-labeled nucleotides. Sequestering proteins, by their nature protect GTPases from GEF or GAP activity, so can be used as competitive inhibitors in the commercial GEF or GAP assays, as we did in our recent publication ⁷. The relevant feature of proteins that traffic GTPase are the capacity to bind the GTPase, and this can be tested easily in a pull down assay. An alternative approach to testing protein integrity that is applicable to all binding proteins is to titrate protein eluted from GFP-trap beads with glycine with the same protein removed from GFP-trap beads by enzymatic cleavage. The experiment would be analyzed by probing both the GFP-tagged and cleaved protein with an antibody against the protein itself. If the protein is undamaged by elution, equilibrium should be achieved at a 1:1 ratio. This approach would also indicate whether the presence of the GFP tag itself compromises the binding properties of the candidate protein, though this does require the production of a construct with an enzymatic cleavage site between the tag and the binding protein. Whether the protein is compromised by the tag or the elution step, the problem could be addressed by modifying the protocol to use an alternative purification method. Rather than GFP, binding proteins could be His-tagged, purified using Ni-NTA and analyzed using an antibody against the His-tag. The important feature is that both binding proteins must share a common tag although, if necessary, two tags could be added to a protein, one for purification and the other for detection.

The protocol is designed to investigate competition between interactions with the switch I/II domains. Although the majority of GTPase interactions are mediated by this motif, there are some exceptions, most notably the interactions of GDIs that bind to the prenyl tail, as well as obscuring the switch domains. In principle, the protocol could be adapted to use GTPase purified from mammalian cells, so that the GTPase is prenylated, however, the presence of multiple binding sites or allosteric effects complicate the interpretation of competition-binding data. Further problems associated with such a modification are that GDIs co-purify with GTPase from mammalian cells, compromising the purity of the isolated proteins and the hydrophobic nature of the prenyl groups means that prenylated GTPases are associated with either GDI or lipid membrane and such factors would need to be considered in the experiment.

The amount of GST-Rac1 being used in the assay. The constant GTPase binding protein must be at a greater concentration than the Rac1, or when the competitor is added, it will simply bind to free Rac1. It will be immediately obvious if this has happened as binding of the competitor, without a loss of the constant protein, will be detected in much the same way as when the two competing proteins bind to one another as shown in Figure 3B. As an additional control (Step 5.3), a binding reaction containing double the amount of constant binding protein and no variable binding protein should be included (Step 5.3). If the Rac1 in the titration experiment is saturated, doubling the amount of constant binding protein will have no effect on the output. The volumes suggested in the protocol should be appropriate, but the amount of Rac1 can be easily reduced. If binding of the competitor without loss of the constant binding partner is observed, reducing the amount of Rac1 should be attempted before trying to map binding sites to avoid ternary complex formation.

Non-specific interaction of GTPase-binding proteins with the GST or bead, as well as specifically with Rac1. This problem would be manifested by residual binding of the constant GTPase-binding protein, even when the variable GTPase-binding protein has reached a plateau at high concentration. Identification of this issue will be aided by conducting reciprocal experiments where the constant and variable GTPase-binding proteins are swapped. Reciprocal experiments will also greatly improve the accuracy of the estimate of equilibrium point, so should always be included. In cases of non-specific binding, the relative concentrations at which equilibrium is achieved can still be calculated by comparing band intensity between the maxima and minima for each protein, or by measuring the extent of non-specific binding by using GST beads as bait, rather than GST-Rac1.

Pull down assays using different nucleotide-loading conditions should be used to complement the competition assay described in this protocol. Determining the nucleotide preference of partners is important for both understanding the competition events and understanding the signaling pathway that the GTPase-binding protein is involved in. In Figure 2B we analyze binding of proteins with established preference for GTP-loaded or nucleotide-free GTPase as a means to validate nucleotide loading. However, it is sensible to investigate the effect of nucleotide loading on each of the competitors as well. If the hypothetical competitors show different preferences, competition will make less of a contribution to the signaling pathway, and indeed nucleotide turnover is likely to be the mechanism that directs exchange of the binding proteins.

Materials

Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE protease inhibitor	Roche	05 056 489 001
Glutathione magnetic beads	Pierce	88821
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution
Blocking Buffer	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP antibody	Living Colors	632592	Use at 1/1000 dilution
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1 antibody	Cell Signaling	2602S	Use at 1/1000 dilution
Odyssey SA Infrared Imaging System	Li-cor	9260-11PC