Быстрое и количественный Флуориметрический Метод белка-таргетинга маленькая молекула наркотиками Скрининг
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
Покажем новый метод скрининга лекарственных препаратов для определения аффинности связывания малых молекул лекарственных средств для целевого белка путем формирования флуоресцентные нанокластеров золота (Au) в течение NCS белка лекарственной загружен на основе сигнала дифференциального флуоресценции, испускаемой Au НК. Альбумин белки, такие как сывороточный альбумин человека (HSA) и бычьего сывороточного альбумина (BSA), выбираются в качестве модельных белков. Четыре маленьких молекулярных препараты (например, ибупрофен, варфарин, фенитоин, и сульфаниламидные) различных аффинности связывания альбумина белков проходят испытания. Было обнаружено, что скорость образования флуоресцентных Au НК внутри лекарственной загружен альбумина в денатурирующих условиях (т.е. 60 ° С или в присутствии мочевины) происходит медленнее, чем образуется в нетронутом белка (без препаратов). Кроме того, интенсивность флуоресценции в качестве сформированной НК будет обнаружено, что обратно коррелирует с аффинностью связывания этих препаратов альбумина к белкам. В частности,Чем выше связывания препарат белка аффинной, тем медленнее скорость образования Au NCS, и, таким образом, наблюдается более низкий интенсивность флуоресценции полученного Au НК. Интенсивность флуоресценции полученных Au НК, следовательно, обеспечивает простой мерой относительной силы связывания различных препаратов тестируемых. Этот метод также выдвижной для измерения специфического связывания препарат белка константу (KD) простым изменением содержания лекарственного предустановленной в белке при концентрации белка фиксированной. Результаты измерений хорошо согласуются со значениями, полученными с помощью других престижных, но более сложные методы.
Introduction
Сывороточные альбумины, такие как сывороточный альбумин человека (HSA) и бычьего сывороточного альбумина (BSA) наиболее распространенный белок в плазме и играют важную роль в поддержании осмотического давления крови отсеке. Они также признаны белками-носителями для малых молекул с низкой растворимостью в воде, такие как стероиды, жирные кислоты, гормоны щитовидной железы, а также широкое разнообразие препаратов. Связывание имущество (например, сайты связывания, аффинности связывания или силы) этих молекул в сыворотке крови альбумины образует важную тему в фармакокинетики. 1-4 Несколько аналитические методы были разработаны для изучения связывающие свойства различных препаратов в сыворотке альбуминов, например, рентгеновской кристаллографии, 5,6 ядерного магнитного резонанса (ЯМР), 7-11 и поверхностный плазмонный резонанс (SPR), 12,13 и др Тем не менее, эти методы ограничены либо утомительной и трудоемкий процесс анализирующего (например, рост монокристалла для рентгеновской crystalloграфический кабинет), требование специального и дорогостоящего оборудования (ППР), или в необходимости дорогостоящего изотопной метки (ЯМР) для обнаружения. Поэтому весьма желательно разработать альтернативные способы для малого молекулярного скрининга наркотиков в быстром, прямо-вперед, и экономически эффективным способом.
Золотые нанокластеры (Au НК) представляют собой особый тип наноматериала, которые содержат несколько десятков атомов металла с размерами меньше, чем 2 нм. 14-17 Они привлекли обширные научные интересы в связи с их дискретной и размер зависит от электронной структуры, 18, 19 и молекулярно-как поглощения и выбросов. 20-23 Такие свойства уникальные материалы, в частности, сильная флуоресценция, нашли разнообразные приложения, такие как зондирования и визуализации в биологических системах. 24-32 сверхмалых люминесцентные Au НК может быть синтезирована с использованием функциональных белков, такие как сывороточные альбумины, в качестве матрицы. 33 В типичном белка-шаблонный синтеза Au НК, определенное количество Au солей сначала инкапсулируются внутри белка, а затем уменьшается самого белка. Восстановительный способность белка объясняется учредительных функциональные аминокислотные остатки (например, тирозин), которые могут быть активированы путем увеличения рН раствора до щелочных. Развернув структуры белка рассматривается как важный шаг для формирования Au НК. Это потому, что в разложенном белка, более редуцирующих функциональные группы могут быть подвержены инкапсулированных Au солей. Разворачивания белка может быть достигнуто путем термической обработки или воздействия денатурирующих агентов. Введение малых молекулярных препаратов также могут влиять на процесс, происходящий, т.е. изменения средней точке температура денатурации и энтальпию разворачивания. 34,35 действие всех этих факторов, в свою очередь, могут быть отражены по кинетики образования флуоресцентного Au НК и проявляется в интенсивность флуоресценции полученных Au НК. 36
e_content "> Это видео демонстрирует способ скрининга лекарственных средств путем синтеза Au НТ в лекарственной загружен альбумина белков при более высокой температуре (60 ° C) или в присутствии денатурирующих агентов (например, мочевины). Интенсивность флуоресценции полученного Au НК это сигнал считывания. Во-первых, Au НК синтезируют в шаблонах HSA и BSA, обработанных при 60 ° С или в присутствии мочевины, чтобы показать, как разворачивания белка (индуцированное термообработки или денатурирующих) воздействует на формирование кинетики Au НК. Во-вторых, Au НК синтезируют в шаблонах белка с предустановленной различных препаратов, и нагрузка препарат влияет на относительные интенсивности флуоресценции полученного Au НК изучается, которые обеспечивают меру относительной связывающей силы. И, наконец, протокол скрининга Au НК-препарат модифицированы для количественное измерение наркотиков белка константа связывания (К D) путем изменения содержания наркотиков предустановленной в белке фиксированной концентрации.Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важных шагов, которые должны быть выделены в этом методе. В протокол скрининга относительной аффинности связывания различных низкомолекулярных препаратов, шаги 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 и имеют решающее значение для получения хороших результатов, показывая устойчивую тенденцию к от…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. . Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -. e. The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. . Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).
